• 应用纪要

亲水作用液相色谱(HILIC)方法迁移第1部分：从传统HPLC系统到Alliance™ iS HPLC System

亲水作用液相色谱(HILIC)方法迁移第1部分：从传统HPLC系统到Alliance™ iS HPLC System
  • Elom Y Pedanou
  • Paula Hong
  • Neil J. Lander
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要介绍了不同行业如何成功地完成传统HPLC系统的方法迁移 — 从亲水作用液相色谱(HILIC)到Alliance iS HPLC System。由于HPLC仪器设计的差异，在进行HILIC方法迁移时可能会影响结果，这一点颇为棘手。Alliance iS HPLC System是一套设计精良的系统，有助于克服这些挑战，实现无缝迁移。本研究在两套传统HPLC系统上分析了美国药典(USP)中关于盐酸西替利嗪含量检测和有机杂质的各论方法，并将其迁移到Alliance iS HPLC System上。三套系统均符合适应性要求，并得到了相当的结果。

优势

  • 将HILIC方法从标准HPLC系统无缝迁移至Alliance iS HPLC System
  • 提升信噪比 (S/N)

简介

大多数受法规监管的实验室，例如药物质量控制(QC)实验室，都采用高效液相色谱(HPLC)系统分析中间体和终产物。在考虑购买新的HPLC系统时，是否能顺利迁移经过验证的现有方法就显得至关重要。方法的特定属性可能会增加该过程的复杂性。例如，亲水作用液相色谱(HILIC)分离使用高有机含量流动相，并且使用的清洗液不同于更典型的反相色谱(RP)所用的清洗液。这导致了与HILIC方法相关的特定注意事项和挑战。

在本研究中，通过使用USP中的盐酸西替利嗪含量测定和有机杂质各论方法，评估HILIC方法从传统HPLC系统到Alliance iS HPLC System的迁移1。方法性能则通过分析系统适用性要求进行评估：拖尾因子、分离度、信噪比(S/N)、峰面积%RSD和保留时间%RSD。

实验

含量测定

根据USP各论方法的描述，使用流动相制备标准溶液，浓度为0.5 mg/mL盐酸西替利嗪（CAS编号：83881-52-1）。

有机杂质

  • 使用流动相制备系统适用性溶液，浓度为4.0 µg/mL盐酸西替利嗪和4.0 µg/mL西替利嗪相关化合物A（CAS编号：246870-46-2）
  • 使用流动相制备灵敏度溶液，浓度为0.1 µg/mL盐酸西替利嗪
  • 使用流动相制备标准溶液，浓度为0.5 µg/mL盐酸西替利嗪

液相色谱条件

液相色谱系统：

1. 传统系统1

2. 传统系统2

3. Alliance iS HPLC System

检测：

1.2489紫外/可见光检测器，波长230 nm，采集速率10点/秒

2. 可变波长检测器(VWD)，波长230 nm，频率6.87 Hz

3. 双波长UV检测器，波长230 nm，采集速率10点/秒

样品瓶：

TruView pH控制LCMS认证最大回收样品瓶, (P/N: 186005662CV)

色谱柱：

XBridge™ BEH™ HILIC色谱柱, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm × 250 mm (P/N: 186004454)

柱温：

25 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

10 µL

流速：

1.0 mL/min

流动相：

乙腈(ACN)、水和1 M硫酸(93:6.6:0.4)

洗针液：

ACN:水(93:7)

方法：

含量测定：等度方法，10分钟

有机杂质：等度方法，18分钟

数据管理

色谱软件：

Empower™ 3 FR4

Empower 3.7

结果与讨论

根据盐酸西替利嗪各论方法，含量测定方法和有机杂质分析方法需要使用相同的流动相和色谱柱，以便进行连续分析。本研究在每次分析之前制备流动相和样品，每个系统均使用新色谱柱。每根新色谱柱在分析前均需老化12小时。所有HPLC系统都遵循相似的样品序列。使用流动相和含量测定标准品进行含量分析，使用系统适用性溶液、灵敏度溶液、有机杂质标准品溶液和流动相进行有机杂质分析。

包括标准品进样在内的分析结果证明，该方法能够在HPLC系统之间成功迁移。与含量测定标准品相关的系统适用性要求（表1）包括峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)不得超过(NMT) 0.73%，拖尾因子NMT不得超过2.0（表1）。对于该等度方法，其一，保留时间和拖尾因子可能会受到色谱柱和方法条件的影响，因为HILIC方法通常需要较长的平衡时间。其二，峰面积%RSD最有可能受到系统进样精密度的影响，在同时使用高有机含量样品稀释剂（>93%乙腈）的情况下，较为严苛的峰面积%RSD要求(NMT 0.73)可能难以满足。三款系统均符合系统适用性标准，而Alliance iS HPLC System（配备新设计的样品计量泵）产生的总峰面积RSD最低，仅为0.042%。

有机杂质分析方法要使用标准品、系统适用性溶液和灵敏度溶液，其中后者用于确保系统适用于定量低浓度杂质。适应性要求为：保留时间和峰面积NMT 2.0%（标准品），信噪比不低于(NLT) 10（灵敏度溶液），USP拖尾因子≤2，西替利嗪和西替利嗪相关化合物A的USP分离度≥2（系统适用性溶液）。如图1所示，所有系统产生的色谱结果相当。虽然所有系统均满足适应性要求（表2），但Alliance iS HPLC System的S/N高于传统系统，并且峰面积RSD最低。

表1.在传统系统和Alliance iS HPLC System上进行盐酸西替利嗪含量测定的系统适用性结果。
图1.有机杂质系统适用性溶液在所有三套HPLC系统上的代表性色谱图。
峰1 = 西替利嗪相关化合物A。峰2 = 盐酸西替利嗪

表2.盐酸西替利嗪有机杂质在传统系统和Alliance iS HPLC System上的系统适用性结果

注：括号中的传统系统2 USP信噪比是使用以空白样指定区域为中心的噪音计算得出的（见下文）。

使用自定义计算方法计算信噪比：残留的影响

由于最近USP通则<621>发生了变更，现行指南规定计算信噪比(S/N)时应使用空白进样，如果可能，以峰保留时间为中心，用半峰高处峰宽乘以5设置噪声区域2。 但是，由于需要空白进样，因此空白样中的任何无关峰都可能影响S/N计算，包括溶剂峰或残留。

在本分析中，S/N根据空白样计算，以峰为中心，用半峰宽乘以5。虽然所有系统均符合系统适用性标准，但传统系统2的灵敏度最低。通过审查数据发现，在传统系统2的空白色谱图中目标分析物的洗脱附近有一个峰（图2）。目标峰的保留时间对齐表明可能存在残留。虽然现代HPLC方法有各种针清洗设计，但许多传统HPLC系统几乎没有选件可以清洗在进样针上进过样的样品。相比之下，在Alliance iS HPLC System的进样周期中，进样前后进样针和穿刺针均会不断抽出，经过清洗溶剂的清洗。因此，Alliance iS HPLC System在空白样中未观察到可观察的峰，S/N更高（图3）。

图2.在传统系统2上用于计算信噪比的包含残留的空白样（上图）以及灵敏度溶液（下图）的代表性色谱图。
图3.在Alliance iS HPLC System上用于计算信噪比的空白样（上图）以及灵敏度溶液（下图）的代表性色谱图。

虽然传统系统2也满足系统适用性标准，本分析还评估了一种替代方法，用于在无任何残留干扰的情况下计算S/N。该方法使用不受残留影响的不同空白区域。计算时使用自定义字段。自定义字段的创建过程如下：

1. 在样品组方法中标记“空白”（图4）。

图4.使用单次空白进样或使用标签定义计算S/N。

2. 使用样品间语法创建自定义字段，在公式字段框中输入空白进样的标签定义（图5）。完整公式如下：

2*(峰高-(0.5*空白样.1.(峰到峰噪音/缩放至µV)))/空白样.1.(峰到峰噪音/缩放至µV)。

图5.使用空白样品计算S/N的自定义字段。

3. 在处理方法的“适用性”选项卡中设置S/N的噪音值。对于该自定义字段，Noise Value for s/n（S/N的噪音）值必须为Peak to Peak Noise（峰到峰噪音）（图6）。

图6.处理方法的“适用性”选项卡。

4. 接下来，在处理方法的“噪音和漂移”选项卡中设置适当的区段以用于空白样（图7）。 

图7.处理方法的“噪音和漂移”选项卡，所选区段位于空白样上。
图8.选择空白进样中的区段用于S/N计算。

使用此样品内自定义计算方法，重新处理后传统系统2的S/N结果从21.32增加到85.53，证明空白S/N值中存在外来峰的影响。

结论

Alliance iS HPLC System等现代HPLC系统具有许多优势，例如可以成功运行传统HPLC系统中的方法，并产生与之相似甚至更好的S/N结果。能够将常规分析中存在问题的HILIC方法从传统HPLC系统成功迁移至Alliance iS HPLC System。使用Alliance is HPLC System进行盐酸西替利嗪含量测定和有机杂质USP方法迁移符合所有适用性标准，并且色谱性能媲美传统系统，峰面积%RSD和灵敏度略有改善。此外，由于Alliance iS HPLC System改进了针清洗机制，因此未观察到残留。

参考资料

  1. Monograph: USP. Cetirizine Hydrochloride.In: USP-NF.Rockville, MD: USP; 01 Sep 2021.DOI: https://doi.usp.org/USPNF/USPNF_M2902_06_01.html
  2. General Chapter: USP.621 Chromatography.In: USP-NF.Rockville, MD: USP; 01 Apr 2023.DOI: https://doi.usp.org/USPNF/USPNF_M99380_07_01.html
  3. “如何创建样品间自定义字段 - 提示93”。沃特世，2022年11月11日，https://support.waters.com/KB_Inf/Empower_Tips_of_the_Week/WKB68884_How_to_create_an_Intersample_Custom_Field

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