• 应用纪要

流动相pH对肽类LC-MS分析方法反相色谱柱选择性的影响

流动相pH对肽类LC-MS分析方法反相色谱柱选择性的影响
  • Hua Yang
  • Stephan M. Koza
  • Steve Shiner
  • Waters Corporation
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摘要

分离肽类时，可通过改变流动相pH来改变选择性。本应用纪要展示了使用XBridge™ Premier BEH™ C18 130 Å肽分析专用柱和XSelect™ Premier CSH™ C18肽分析专用柱，在pH 2.7~9.2的流动相条件下分离肽标准品和选定的几种NISTmAb™关键质量属性(CQA)胰蛋白酶肽的选择性差异。使用BioAccord™ LC-MS系统和waters_connect™获得的提取离子流色谱图(XIC)显示，所选肽及其脱酰胺形式之间存在明显的选择性差异。

优势

  • 流动相pH可以改变反相肽分离的选择性，有助于分离难分离的关键分析物对

简介

已有研究表明，流动相pH会改变反相分离的选择性。有研究人员通过改变肽分离的pH，成功获得了高度正交性1。 本应用纪要展示了使用pH分别为2.7、3.1、3.8、5.5、6.5和9.2的流动相分离肽混标以及mAb胰蛋白酶酶解物样品的选择性差异。作为示例，文中给出了使用BioAccord LC-MS系统和waters_connect获得的提取离子流色谱图(XIC)，以展示胰蛋白酶肽及其脱酰胺形式的分离结果。使用pH不同的流动相分离样品时，选择性表现出显著的差异，这表明改变流动相pH对难分离关键分析物对的分离可能会有帮助。

实验

样品描述

将MassPREP™肽混标（P/N：186002338）和mAb胰蛋白酶酶解标准品（P/N：186009126）分别复溶于100 μL和80 μL的0.1%甲酸中。

液相色谱条件

液相色谱系统：

ACQUITY™ UPLC I-Class PLUS（系统总谱带展宽5σ≤7 µL）

检测：

ACQUITY BioAccord MS检测，TUV @ 214 nm

色谱柱：

XBridge Premier BEH C18 130 Å, 2.5 µm, 2.1 x 150 mm肽分析专用柱（P/N：186009835）

XSelect Premier CSH C18 130 Å, 2.5 µm, 2.1 x 150 mm肽分析专用柱（P/N：186009906）

柱温：

60 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

15 µL，10 µL

流速：

0.2 mL/min

流动相

A：0.1%甲酸水溶液(pH 2.7)
B：0.1%甲酸的乙腈溶液

A：0.1%甲酸和10 mM甲酸铵的水溶液(pH 3.1)
B：0.1%甲酸和10 mM甲酸铵的80%乙腈溶液

A：10 mM甲酸铵的水溶液（pH 3.8）
B：10 mM甲酸铵的80%乙腈溶液

A：10 mM乙酸铵的水溶液（pH 5.5）
B：10 mM乙酸铵的80%乙腈溶液

A：10 mM乙酸铵的水溶液（pH 6.5）
B：10 mM乙酸铵的80%乙腈溶液

A：10 mM甲酸铵的水溶液（pH 9.2）
B：10 mM甲酸铵的80%乙腈溶液

分析MassPREP肽混标的梯度表，流动相pH 2.7*

*：使用pH 3.1至pH 9.2的流动相时，由于流动相B中含有80% ACN，采用流动相B从0.6%变为68.8%的梯度。

分析mAb胰蛋白酶酶解标准品的梯度表，流动相pH 2.7**

**：使用pH 3.1至pH 9.2的流动相时，由于流动相B中含有80% ACN，采用流动相B从0.6%变为62.5%的梯度。

ACQUITY RDa检测器设置

模式：

包括碎片的全扫描

质量范围：

50~2000 m/z

极性：

正

采样速率：

5 Hz

锥孔电压：

30 V

碎裂锥孔电压：

60~120 V

毛细管电压：

1.20 kV

脱溶剂气温度：

350 °C

数据管理

LC/MS软件：

waters_connect

结果与讨论

图1显示了在不同的流动相pH条件下，使用两根Premier C18肽分析专用柱分离MassPrep肽混标（组分见表1）得到的UV谱图。根据BioAccord RDa质谱检测器和waters_connect获得的质量数鉴定峰。虽然这两根色谱柱的选择性略有不同，但实验观察到流动相pH变化导致了更显著的选择性差异。值得注意的是，pH > 5.5时，峰9（烯醇酶T37）和峰10（蜂毒肽）的回收率降低了。虽然我们没有研究原因，但推测是由于在pH较高的流动相中，低pI的大分子烯醇酶T37肽溶解度降低，且高pI (>12)的大分子蜂毒肽肽的离子保留性增加。尽管如此，在碱性较强的条件下分离大分子肽时需要谨慎。此外，由于流动相pH的微小变化也可能显著改变选择性，使用高pH流动相时应仔细评估方法重现性。

表1.使用乙腈浓度递增的梯度在不同pH条件下分离的肽（MassPREP肽混标，P/N：186002338）列表（请参见图1）
图1.使用两根Premier C18肽分析专用柱（XBridge Premier BEH C18 130 Å, 2.5 µm, 2.1 x 150 mm肽分析专用柱（P/N：186009835）和XSelect Premier CSH C18 130 Å, 2.5 µm, 2.1 x 150 mm肽分析专用柱（P/N：186009906）），在不同流动相pH条件下使用乙腈浓度递增的梯度分离肽混标获得的UV谱图。

图2a显示了在不同流动相pH条件下，使用乙腈浓度递增的梯度在XBridge Premier BEH C18 130 Å肽分析专用柱上分离NISTmAb胰蛋白酶酶解物得到的基峰强度(BPI)。颜色相同的箭头表示waters_connect鉴定出的同种胰蛋白酶肽。重链T37肽(GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK)以红色突出显示。图2b显示了重链T37肽及其脱酰胺形式的提取离子流色谱图(XIC)。在不同的流动相pH条件下，选择性差异很大。图2c显示了42种肽在不同pH下的保留时间与这些肽在pH 2.7下的保留时间的相关性图。相关性(R2)随流动相pH升高而降低。这表明较高的pH条件与低pH条件(pH 2.7)之间的正交性更高（R2更低），与之前的研究结论一致1。基于10种强度最大的肽离子，计算出pH 9.2甲酸铵条件下的平均响应约为0.1%甲酸(pH 2.7)条件下平均响应的三分之一。

图2.在各种pH流动相条件下使用XBridge Premier BEH C18 130 Å 2.5 µm 2.1 x 150 mm肽分析专用柱分离NISTmAb胰蛋白酶肽得到的结果。a. BioAccord LC-MS系统获得的基峰强度(BPI)色谱图。颜色相同的箭头表示waters_connect鉴定出的同一种肽。HC T37肽(GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK)以红色突出显示。b. HC T37肽及其脱酰胺形式在各种pH流动相条件下的提取离子流色谱图(XIC)。c.不同pH流动相条件下保留时间的相关性。

结论

本研究使用两根Premier C18肽分析专用柱在pH 2.7~pH 9.2的各种流动相pH条件下对肽混标和mAb胰蛋白酶酶解物样品进行了反相分离。采用乙腈浓度递增的梯度，在不同流动相pH条件下观察到了显著的选择性差异，这对开发难分离关键肽对的分析方法具有指导意义。一般而言，对于常规的合成肽和肽图分析分离，可在反相洗脱液中添加低pH甲酸（例如在质谱分析中使用0.1%甲酸）或三氟乙酸（例如在光学检测中使用0.1% TFA）作为添加剂。不过，如本研究所示，如果要改进表征比较研究，采用高pH的分离方案可能会有所帮助，因为这有助于获得不同的肽分离选择性（即正交性），使得评估更加全面。此外，杂化硅胶基质BEH和CSH肽分析专用柱具有较高的pH稳定性，因此可在同一样品组中使用同一色谱柱运行低pH和高pH方法。

参考资料

  1. Gilar M., Olivova P., Daly A.E., Gebler J.C. Development of Orthogonal Separation Methods for 2D-HPLC (MS/MS) Analysis of Peptides.Waters Poster, 2005.

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