MaxPeak™ Premier色谱柱在生物分析工作流程中对峰形的改善及其对SPE结果的影响

分析物与LC色谱柱或LC系统的裸露金属表面相互作用时，可能发生非特异性吸附^1-2。 这种相互作用可能会导致样品被金属表面吸附，进而损失样品，还会导致峰拖尾，峰形往往也比较差。这个问题对于某些关键分析而言尤其棘手，检测固相萃取(SPE)后样品中的化合物就是这样一个例子。作为一种常用技术，SPE不仅能去除样品中的不良基质组分（例如磷脂或蛋白质），还可以浓缩样品，使分析物更易检测和定量。即使已经适当净化样品去除任何干扰物，SPE后样品的非特异性吸附仍然可能导致回收率不佳或变异性过高。本研究将尼古丁及其三种代谢物加标到收集的口腔液中，样品经SPE处理后使用不锈钢色谱柱和MaxPeak Premier高性能表面(HPS)色谱柱进行分析。使用不锈钢色谱柱时观察到的变异性更高，且去甲烟碱的峰形较差，这凸显出使用MaxPeak Premier色谱柱分析这类样品的优势，即有助于消除疑虑和确保SPE处理之后获得准确的结果。 

优势

• 直接使用Oasis™ PRiME MCX吸附剂和4步方案，不需要开发SPE方法
• 回收率计算值体现出良好的重现性
• LC-MS分析获得的峰更尖锐、更对称，有助于更好地积分和定量

非特异性吸附(NSA)会对LC-MS应用产生巨大影响^3-8。从峰面积小到峰形差（影响积分），NSA造成的各种后果对关键分析极为不利。减少NSA的方法有很多，包括但不限于用样品基质或“牺牲样品”钝化系统、在流动相中添加钝化剂（如亚甲基二膦酸），甚至还包括使用PEEK材质或带PEEK内衬的色谱柱和系统管路。虽然这些方法各有所长，但它们都可能造成比NSA更严重的负面影响。钝化剂（如亚甲基二膦酸）可作为离子交换剂影响分析物电离，进而影响LC-MS信号。使用基质或样品钝化系统和色谱柱虽然在短期内有效，但成本高昂，而且必须定期重复钝化过程才能保持分析性能。最后，PEEK材质和带PEEK内衬的色谱柱生产过程可控程度较低，因此柱间差异性较大，不适合使用寿命较长的分析方法。

MaxPeak Premier高性能表面(HPS)技术通过对色谱柱和系统硬件的不锈钢组件进行有机-无机杂化表面处理，解决了NSA带来的所有问题。这种表面处理技术可防止分析物直接与金属表面相互作用，从而改善峰形并减少吸附效应造成的样品损失。该技术在生物分析工作流程中特别有用，此类工作流程通常涉及固相萃取和低浓度分析物。许多生物分析工作流程都采用固相萃取(SPE)技术来减少基质干扰物和提高分析物浓度，然而，即使在SPE处理之后，分析物浓度仍然很低。众所周知，分析物浓度越低，NSA对样品吸附的影响就越大，在生物分析工作流程中确定检测限和定量限的难度也会更大^1,8。MaxPeak Premier HPS色谱柱可减少NSA，提高分析物定量的准确性。为了证明这一点，本研究在采集的口腔液样品中加标尼古丁及其三种代谢物，并使用Oasis PRiME MCX样品前处理装置做了样品前处理。然后，使用填充同一批BEH™ C₁₈ 2.5 µm颗粒的不锈钢和MaxPeak Premier HPS硬件色谱柱分析了这些样品。

样品描述

用水配制浓度为1 mg/mL的化合物（尼古丁和可替宁）储备液。羟基可替宁和去甲烟碱储备液购自Cerilliant，为1 mg/mL甲醇溶液。用水配制浓度分别为6.25 µg/mL（先加标溶液）和2.08 µg/mL（后加标溶液）的固相萃取(SPE)工作溶液。

样品前处理

使用Quantisal口腔液收集装置收集非吸烟者的口腔液用作空白样。为避免样品降解，样品在同一天收集并使用。使用Oasis PRiME MCX µElution板（P/N：186008914）净化样品。向其中几个采集的口腔液样品中加标分析物，并用4%磷酸水溶液进行预处理(1:1)。随后执行Oasis PRiME MCX 4步净化方案，包括用含2%甲酸的100 mM甲酸铵溶液和甲醇进行清洗⁹。使用5%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱样品，然后立即放入系统等待进样。所有步骤使用的体积都基于SPE形式，在本例中为µElution板¹⁰。用于LC-MS分析的最终样品中，四种分析物的浓度均为50 ng/mL。 

尼古丁是一种常见化学物质，存在于卷烟、雪茄，甚至电子烟烟油等烟草类产品中。监测口腔液中的尼古丁及其代谢物已成为戒烟治疗的一部分，也是评估吸烟量的手段之一。口腔液通常使用Quantisal口腔液收集装置等设备以非侵入方式收集。收集过程是将一片装置置于舌下，等待收集到足够的液体。然后将装置放入储存溶液中以便运输和分析。储存溶液中通常含有稳定缓冲液，确保样品不会发生降解。

为了凸显MaxPeak Premier HPS技术在生物分析工作流程中的优势，本研究采集了非吸烟者的口腔液样品。由于收集对象从不吸烟，体内不会有任何尼古丁或其代谢物，该样品被用作空白基质。使用Quantisal收集样品后，按Oasis PRiME MCX方案对样品进行SPE处理。由于样品量有限，且本研究需要浓缩口腔液中的分析物，我们使用了Oasis PRiME MCX 96孔µElution板。由于尼古丁及其三种代谢物（去甲烟碱、可替宁和羟基可替宁）在低pH条件下均带电荷，在高pH条件下呈中性，因此优选阳离子交换SPE板。按照Oasis PRiME MCX 4步方案处理样品，然后使用XBridge BEH C₁₈和XBridge Premier BEH C₁₈色谱柱进行分析。两根色谱柱均采用2.1 x 50 mm硬件，其中均填充同一批2.5 µm BEH C₁₈颗粒。两根色谱柱之间唯一的区别在于有没有使用基于MaxPeak Premier HPS技术的硬件。之所以选择BEH C₁₈颗粒，是因为分析物在高pH条件下的保留性和分离效果更好，而BEH颗粒技术经过专门设计，在高pH条件下仍可保持稳定。

完成SPE处理和随后的LC-MS分析后，我们计算了使用这两根色谱柱时的分析物回收率百分比，结果如图2所示。

虽然样品都是相同的，并且都在同一天分析，不锈钢色谱柱和MaxPeak HPS色谱柱的数据之间仍然表现出一些差异。尽管所有分析物的回收率百分比都在80%~120%之间，误差棒也都在合理范围内，但不锈钢色谱柱得到的去甲烟碱数据的标准差(11%)明显高于MaxPeak HPS色谱柱分析同一个样品得到的数据的标准差(2.5%)。两根色谱柱分析其他三种化合物得到的结果相当。在研究去甲烟碱的回收率标准差为何较高时，我们发现两根色谱柱得到的色谱图之间有明显差异，如图3所示。

如红色迹线所示，与MaxPeak Premier HPS色谱柱相比，不锈钢色谱柱得到的去甲烟碱峰(3)更宽，而且峰有些拖尾。峰形稍差意味着峰的积分和定量难度更大，结果可靠性也不如对称的峰。因此，不对称宽峰的回收率百分比和标准差可变性略高。不锈钢色谱柱分析其他分析物得到的峰形与MaxPeak Premier HPS色谱柱相当。本研究使用MaxPeak Premier HPS色谱柱更准确地定量了SPE样品，这在生物分析工作流程中至关重要。虽然本研究未做测试，使用不锈钢色谱柱得出的检测限和定量测定可能会因样品损失而偏高。使用MaxPeak Premier HPS色谱柱可消除非特异性吸附，从而准确测定样品，更好的峰形有助于检出低浓度分析物并准确积分和定量。

MaxPeak Premier高性能色谱柱能减少分析物与仪器系统和色谱柱中任何裸露金属表面之间的次级相互作用。这些次级相互作用通常会导致非特异性吸附和分析物损失，进而造成峰形畸变和峰面积变小的后果。在SPE后的分析中，峰面积小或峰形不佳会影响积分和定量，导致回收率不理想或误差棒过宽。这会增加结果的不确定度，SPE方案的样品净化效果也得不到充分体现。

本研究向使用Quantisal收集装置收集的口腔液样品中加标尼古丁及其代谢物，然后按照推荐的Oasis PRiME MCX 4步方案使用μElution板处理样品。采用这套推荐的方案，无需开发SPE方法即可获得纯净样品供进一步分析。完成SPE处理后，分别在不锈钢XBridge BEH C₁₈色谱柱和使用MaxPeak HPS技术的XBridge Premier BEH C₁₈色谱柱上分析洗脱液。虽然两根色谱柱都得到了可接受的回收率和误差棒，但不锈钢色谱柱结果中去甲烟碱的误差棒明显更宽。从色谱图中可以看出，使用不锈钢色谱柱分析样品时，去甲烟碱发生了峰拖尾，因此峰形较差。MaxPeak Premier HPS色谱柱得到的峰形明显更好，有助于实现更准确的峰积分，获得更一致的结果。使用MaxPeak Premier HPS ACQUITY分析SPE处理后的样品可以提高所得数据的可靠性和准确性，有助于消除针对SPE效果的任何疑虑，让分析结果更清晰明了。

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