将氨基酸分析方法从ACQUITY™ UPLC™系统成功迁移至ACQUITY Premier二元固定定量环系统的仪器注意事项
摘要
氨基酸分析是多种样品的常规分析项，包括水解蛋白质、细胞培养物以及食品和饲料样品。沃特世开发了ACQUITY UPLC AAA解决方案，其中包括柱前衍生试剂盒、亚2 µm色谱柱和适用于UPLC分析的预包装流动相2。 随着仪器不断更新换代，将方法成功迁移至新系统的能力变得越来越重要。本研究将介绍将一种柱前衍生化方法从ACQUITY UPLC系统迁移至ACQUITY Premier二元固定定量环系统的注意事项。展示分离方法经过调整和优化后的各项性能，包括线性、重复性、重现性、定量限和检测限。
优势
- ACQUITY Premier二元系统为棘手梯度提供了出色的精密度，并且加快了分析速度，可实现高通量分析
- 调整方法后，所有关键性能特征（包括峰形、分离度、线性、定量限和中间精密度）均得以保持
- AccQ•Tag™ Ultra化学品套装内含色谱柱、标准品、洗脱液和衍生化试剂盒，可实现快速、可靠且可重现的氨基酸衍生化、分离和定量
- ACQUITY Premier二元系统采用了MaxPeak高性能表面(HPS)，旨在通过尽可能减少分析物/表面相互作用避免损失样品，从而提高分析物回收率、分析灵敏度和重现性。
简介
由于氨基酸的紫外光吸收能力很弱甚至根本不吸收紫外光，并且化学性质各异，氨基酸分析(AAA)可能非常具有挑战性。鉴于这些挑战，我们发现，使用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)进行柱前衍生化，然后再进行反相分离，对于使用UHPLC/UPLC系统的氨基酸定量分析而言，是一种具有高重现性的技术1。 然而，随着分析系统不断更新换代，在保持方法性能的前提下顺利迁移氨基酸分析解决方案至关重要。本研究要将使用ACQUITY UPLC开发的旧方法迁移至一款更新的液相色谱平台：ACQUITY Premier二元固定定量环系统，这两款系统在设计上存在一些明显的差异，可能会对方法迁移产生影响。为了弥补这些差异，我们不得不修改了一些方法参数，不过最终方法条件得到的结果与ACQUITY UPLC系统运行原始方法得到的结果几乎相同。
实验
液相色谱条件
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液相色谱系统： |
带被动预加热功能和在线过滤器的ACQUITY UPLC系统；带主动色谱柱预加热功能和在线过滤器的ACQUITY Premier二元固定定量环系统 |
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检测： |
ACQUITY UPLC系统 - 配备10 mm UPLC分析型流通池和CH-A柱温箱的ACQUITY TUV检测器 ACQUITY Premier二元固定定量环系统 - 配备10 mm UPLC分析型流通池和CH-A柱温箱的ACQUITY TUV检测器 |
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波长： |
260 nm |
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采集速率： |
10 Hz |
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样品瓶： |
LCGC认证透明玻璃12 × 32 mm螺纹颈口全回收样品瓶，带瓶盖和PTFE/硅胶隔垫（无预开口）（P/N：186000384C） |
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色谱柱： |
AccQ•Tag Ultra C18, 1.7 µm 2.1 x 100 mm（P/N：186003837） |
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柱温： |
ACQUITY UPLC系统：55 ℃（水解产物、食品和饲料），60 ℃（细胞培养物） ACQUITY Premier固定定量环系统：55 ℃（水解产物、食品和饲料），50 ℃（细胞培养物） |
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样品温度： |
20 °C |
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进样体积： |
ACQUITY UPLC系统1 μL，ACQUITY Premier二元固定定量环系统0.5 μL |
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进样模式 |
不充满定量环（使用针溢出）(PLNO) |
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流速： |
0.7 mL/min |
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流动相A： |
AccQ•Tag洗脱液A（P/N：186003838）按1:20稀释，用于分析水解产物以及食品和饲料 AccQ•Tag洗脱液A按1:10稀释，用于分析细胞培养物 |
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流动相B： |
AccQ▪Tag Ultra洗脱液B（P/N：186003839） |
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弱洗针液： |
95:5 (v/v)水:乙腈（ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统） |
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强洗针液： |
5:95 (v/v)水:乙腈（ACQUITY UPLC系统） 95:5 (v/v)水:乙腈（ACQUITY Premier二元固定定量环系统） |
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密封清洗液： |
50:50 (v/v)水:乙腈（ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统） |
梯度表
数据管理
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色谱数据系统： |
Empower™ 3，FR 3.7.0 |
结果与讨论
由于温度、梯度输送及其他条件的细微变化会影响保留性和选择性，各种氨基酸的分离具有挑战性。鉴于这些挑战，如果不同LC系统之间存在差异，可能需要针对具体系统优化方法。在本研究中，我们将调整ACQUITY UPLC系统氨基酸分析总体解决方案中的2.1 x 100 mm色谱柱分析方法，确定从蛋白质水解产物中分离氨基酸的方法条件1。 使用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)进行氨基酸柱前衍生化，然后使用反相液相色谱分离衍生物1。
仪器注意事项
我们在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上测试了ACQUITY UPLC AccQ•Tag Ultra解决方案中的仪器方法。为了获得足够高的分离度和色谱性能，该方法需要调整。评估最终方法条件时，我们在ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统这两套系统上做了测试。两套系统均由二元泵、固定定量环样品管理器和TUV（可变波长）检测器组成。它们之间的差异包括ACQUITY UPLC系统带被动预加热功能而ACQUITY Premier二元固定定量环系统带主动色谱柱预加热功能，二者的系统扩散体积也有细微差异。
HPLC氨基酸分离方法优化
为确保实验结果中的差异不是标准品和样品造成的，我们统一对标准品和样品进行了前处理、衍生化处理、混合和分装。流动相也是大批量配制后分装给两套系统使用。为减少色谱柱造成的差异，两套系统都使用相同的色谱柱。
不做任何调整就直接将方法迁移至ACQUITY Premier二元固定定量环系统，会导致组氨酸发生峰畸变，这可能是由于系统扩散体积较低引起了强溶剂效应（图1）。ACQUITY Premier二元系统能达到氨基酸分析所需的灵敏度、运行棘手梯度所需的精密度，以及实现高通量分析所需的运行速度2。 我们对方法做了若干调整并进行评估，包括将强洗针液从5:95水/乙腈改为95:5水/乙腈。
最后考察了进样体积的调整。经衍生化处理后，进样溶剂中的有机溶剂含量(20%)比方法初始条件要高一些，因此减少进样体积可以改善组氨酸峰形。在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上，当进样体积超过0.5 µL时，组氨酸产生了明显更大的峰畸变，因此认为该系统采用0.5 µL的进样体积是可接受的（图2）。此外，考虑到进样体积减半，我们还评估了灵敏度。
图1.确定蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上的进样体积的色谱图
图2.ACQUITY UPLC系统分析蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)得到的色谱图
调整各系统的进样体积后，我们使用水解产物标准品比较了色谱性能（表1）。结果发现两套系统分析水解产物氨基酸都能得到可接受的USP分离度(>2.0)和峰形（图2和3）。
表1.ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析水解产物标准品(500 µM)的UPS分离度和拖尾因子
图3.在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上分析蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)
在ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统上验证氨基酸分析
我们使用蛋白质AA水解产物标准品和调整后的进样体积(0.5 uL)评估了各系统的性能，确保保留时间和峰面积都能达到足够高的重复性。这两套二元系统的结果相当。500 pmol标准品（柱上进样量25 pmol）六次重复进样的所有保留时间%RSD均<0.5%。
两套系统的峰面积精密度也不相上下。ACQUITY UPLC系统分析所有水解产物氨基酸的峰面积RSD都在0.2%~0.4%范围内。ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析水解产物的峰面积%RSD则在1.1%~1.4%范围内。虽然在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上观察到的峰面积计数略小且%RSD略高，但这两套系统都表现出良好的峰面积重复性。保留时间和峰面积重复性数据如表2和表3所示。
表2.ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)的保留时间结果
表3.ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)的峰面积重复性结果
保留时间和峰面积RSD的中间精密度
除重复性以外，中间精密度对于氨基酸的分析和定量而言也至关重要。在三天内，我们每天在ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统上测试六个样品。利用内标（正缬氨酸）归一化样品前处理中的差异。分析评估了6次进样的日内精密度以及3天内每天6次进样（共18次）的总精密度。
两套系统的结果均表现出较高的日内保留时间精密度和峰面积精密度。在为期三天的分析过程中，所有保留时间的RSD均在1.5%以内，精密度完全处于各系统的预期保留时间范围内。日内峰面积%RSD在1.8%以内，三天内的峰面积%RSD在2.2%以内。结果证明，该分析在ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统上均具有良好的重现性。
表4.ACQUITY Arc和ACQUITY Premier二元固定定量环系统保留时间和峰面积重现性的中间精密度
线性和检测限/定量限
为确保准确定量所有氨基酸，本研究评估了ACQUITY UPLC系统和ACQUITY Premier二元固定定量环系统的线性以及检测限(LOD)和定量限(LOQ)。通过进样分析1~500 µM范围内8个浓度水平的水解产物标准品来确定线性。两款仪器的标准曲线显示，所有氨基酸均获得了可接受的R2 (>0.99)。鉴于标准品在动态范围内的分布，使用1/x的加权因子绘制标准曲线。两套系统按信噪比大于等于10:1定义的定量限(LOQ)均为1 µM。所有高于LOQ的值均表现出<17%的偏差，并且在LOQ水平表现出<30%的偏差。尽管两套系统的进样体积存在差异，但基于3:1的信噪比所确定的检测限(LOD)均为0.5 µM。
表5.使用ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析AA蛋白质水解产物标准品(2~500 µM)得到R2和各浓度水平下的%偏差
我们还计算了几天内测得的浓度相较于标示浓度的偏差(%)以及浓度RSD。两套系统三天内的浓度偏差(%)和RSD都比较低。
表6.用ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析蛋白质水解产物AA标准品(1~500 µM)得到的浓度相较于标示浓度的偏差(%)以及浓度RSD
分离其他氨基酸标准品
我们在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上采用0.5 μL的进样体积分离了其他氨基酸标准品。为实现充分分离，分离细胞培养物标准品时需要达到50 ℃的柱温，分离食品和饲料标准品时需要达到55 ℃的柱温。
图4.在ACQUITY Premier二元固定定量环系统上分离细胞培养物以及食品和饲料AA标准品(500 µM)
由于许多客户都需要同时分析样品中的羟脯氨酸和磺基丙氨酸，因此食品和饲料标准品中添加了羟脯氨酸。这两种氨基酸都在梯度早期（有机相含量低于3%）洗脱，可能需要使用二元泵才能实现可重现的分离。分离很成功，结果如图5所示。
图5.使用ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析加标羟脯氨酸的食品和饲料AA标准品(500 µM)
功能饮料的定量分析
使用ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统对氨基酸混合饮料粉进行定量分析。两套系统运行该方法测定混合饮料粉样品中的氨基酸含量得到的结果相当。图6所示为ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析标准品和样品得到的色谱图。两套系统之间的差异百分比较小，表明定量重现性较高（表7）。
图6.ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析蛋白质水解产物AA标准品(500 µM)和氨基酸混合饮料粉营养补充剂样品的色谱图
表7.ACQUITY UPLC和ACQUITY Premier二元固定定量环系统分析氨基酸混合饮料粉样品的结果
结论
本研究成功将AccQ•Tag Ultra方法从ACQUITY UPLC系统迁移到了ACQUITY Premier二元固定定量环系统。进样体积从原始方法的1 μL更改为0.5 μL，以减少强溶剂效应对组氨酸峰形的影响。我们在两套系统上评估了方法性能，以确保调整进样体积后，线性、精密度、中间精密度、LOD和LOQ结果均可接受。两套系统的整体性能相似，表现为%RSD低且定量结果精确。
此外，本研究还分析了细胞培养物以及食品和饲料标准品。为获得足够好的峰形和分离度，细胞培养物分析方法需要将柱温从60 ℃调整为50 ℃。仅通过减少进样体积就成功分离了加标羟脯氨酸的食品和饲料标准品。
最后，使用调整后的方法分析了两个混合饮料粉样品并比较了两套系统的定量结果。两套系统对混合饮料粉样品中氨基酸含量的定量结果之间，以及定量结果与样品的标签声称值之间都具有良好的一致性。这表明两套系统的定量重现性较高。
参考资料
- Amino Acid Analysis Application Notebook, 720006130, 2020.
- Jennifer Simeone, Paula Hong. 从ACQUITY UPLC到ACQUITY Premier二元系统进行柱前衍生氨基酸分析的仪器注意事项.沃特世应用纪要, 720007440ZH，2021年.
- 《氨基酸标准品试剂盒维护和使用手册》.沃特世维护和使用手册, 720006663ZH.
720008073ZH，2023年10月
