在临床研究中使用Xevo™ TQ Absolute质谱仪对人工脑脊液中的β-淀粉样肽进行LC-MS/MS分析

β-淀粉样(Aβ)肽的序列中包含36~43个氨基酸，是神经退行性疾病患者大脑中沉积的淀粉样蛋白斑块的主要成分，因此在临床研究中，这类肽备受关注。本应用简报证明，ACQUITY™ Premier UPLC I-Class与Xevo™ TQ Absolute质谱仪组成的联用系统可用作一种临床研究工具，高灵敏度、高选择性地定量人工脑脊液(aCSF)中的多种Aβ肽异构体（1-38、1-40、1-42）。

β-淀粉样(Aβ)肽的序列中包含36~43个氨基酸，是神经退行性疾病患者大脑中沉积的淀粉样蛋白斑块的主要成分，因此在新型治疗药物的药效动力学临床研究中，这类肽备受关注。定量检测生物体液中Aβ肽的传统方法主要依赖ELISA等免疫分析技术^1,2。 这些技术可能会发生交叉反应，导致分析方法的批间一致性不理想，进而影响结果可信度。此外，在涉及多种生物标志物的评估中，每种肽都需要单独的ELISA方法，这会增加总体分析时间和成本。因此，分析选择性更高、更稳健的方法将有助于克服这些挑战。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)这项技术有望在Aβ肽临床研究中发挥重要作用。其优势包括分析选择性更高，以及单次运行即可定量检测多种分析物。采用替代基质方法，利用样品前处理、色谱分离和多重反应监测(MRM)质谱检测带来的选择性，可以测定Aβ肽的多种异构体。

本文证明，ACQUITY™ Premier UPLC I-Class与Xevo™ TQ Absolute质谱仪组成的联用系统可用作一种临床研究工具，高灵敏度、高选择性地定量从200 µL人工脑脊液(aCSF)中提取出的多种浓度在0.1~10 ng/mL范围内的完整Aβ肽异构体（1-38、1-40、1-42）。

样品前处理与LC-MS分析

本节沿用了应用纪要720006517中样品前处理和LC-MS分析方法的详细信息，但为了改善分析物保留性做了细微更改³。

对含0.4% (w/v)牛血清白蛋白(BSA)的空白人工CSF进行加标，制成不同浓度的校准工作溶液和质量控制(QC)工作溶液。200 μL加标样品经200 μL 5 M盐酸胍和200 μL 4% (v/v)磷酸稀释后，加入内标工作溶液。样品在室温下温育1 h后，上样至Oasis™ MCX SPE µElution板。按照720006517图1中的方案清洗并洗脱µElution板。在氮气流中挥干洗脱液，然后用50 μL 20:80:1 (v:v:v)的乙腈:水:氨水复溶。

Aβ肽异构体的分离使用配备ACQUITY UPLC BEH C₁₈ 300 Å, 2.1 x 150 mm, 1.7 µm肽分析专用柱的ACQUITY Premier UPLC I-Class FTN系统，流动相为0.3% NH₄OH/水/乙腈，梯度为流动相B从10%升至55%，质谱分析使用Xevo TQ Absolute质谱仪，MRM通道和母离子扫描参数见表1。流动相每日现配。 

在个五分析批中，浓度最低的标曲样品(0.1 ng/mL)中所有Aβ肽异构体（1-38、1-40、1-42）的S/N (PtP)均> 10:1，表现出良好的分析灵敏度（图2）。 

五个分析批中，每种肽在0.1~10 ng/mL范围内的标准曲线都呈线性，r² > 0.999。

三个浓度的QC样品（0.2、1.0和7.5 ng/mL）在五个分析批中重复进样五次(n = 25)，评估Xevo™ TQ Absolute质谱仪分析Aβ肽的总精密度和重复性。总精密度和重复性均< 5% CV，QC样品中每种Aβ肽异构体相较于标示浓度的准确度都在96.1%~100.4%范围内（表2）。 

本研究开发了一种分析人工CSF中Aβ肽生物标志物的LC-MS/MS方法供临床研究使用。该方法使用ACQUITY Premier UPLC I-Class系统和Xevo TQ Absolute质谱仪，展现出良好的日间线性、分析灵敏度、精密度和准确度，能够为Aβ肽异构体（1-38、1-40、1-42）的定量分析提供可靠的结果。

1. Jensen M, Hartmann T, Engvall B, Wang R, Uljon SN, Sennvik K, Naslund J, Muehlhauser F, Nordstedt C, Beyreuther K et al: Quantification of Alzheimer Amyloid Beta Peptides Ending at Residues 40 and 42 by Novel ELISA Systems.Mol Med 2000, 6(4):291–302.
2. Lachno DR, Evert BA, Maloney K, Willis BA, Talbot JA, Vandijck M, Dean RA: Validation and Clinical Utility of ELISA Methods for Quantification of Amyloid-beta of Peptides in Cerebrospinal Fluid Specimens from Alzheimer's Disease Studies.J Alzheimers Dis 2015, 45(2):527–542.
3. Salcedo J, Ph.L, Davey L, Lame M, Dunning C, Chambers E: Amyloid Beta Peptides Quantification by SPE-LC-MS/MS With Automated Sample Preparation for Preclinical Research and Biomarker Discovery.Waters Application Note, 720006517.