使用单克隆抗体定量试剂盒对mAb进行LC-MS/MS分析 - 聚焦英夫利昔单抗

治疗性单克隆抗体(t-mAb)已成为临床医生治疗多种疾病的一种革命性治疗工具。在个性化医疗时代，人们愈发意识到确测定mAb是剂量优化和成本管理的必要前提。用于测定mAb的配体结合试验(LBA)技术已经非常成熟，但存在一些局限性，包括性能不理想、未实现标准化、处理数量较少的样品时成本较高、动态范围比较窄，以及可能存在交叉反应性。此外，市面上可用的试剂盒不多，只能测定有限的几种mAb。质谱技术作为一项临床实验室广泛用于监测小分子的技术，有望替代LBA技术，突破这些限制。在本应用简报中，我们证明液相色谱-串联质谱系统(LC-MS/MS)配合即用型市售mAbXmise试剂盒可以轻松测定mAb，为实验室人员提供了一种分析性能出色、简单易操作，而且灵活性较高的分析方法。本应用简报重点介绍使用这种方法测定英夫利昔单抗(IFX)的实验。

t-mAb是一类重要的药物，从炎症性肠病到各种癌症，许多疾病都可以采用这类药物治疗。目前已获FDA批准的抗体治疗药物超过100种，且过去五年来，欧盟和美国平均每年有10种抗体治疗药物获得首次批准。这些分子彻底改变了患者管理和治疗结局，如今已成为临床医生的重要治疗工具之一。已有文献报道了t-mAb浓度与疗效之间的关系，以及免疫原性导致的疗效损失。鉴于这些研究观察到的结果以及这类药物高昂的成本，人们愈发认识到准确测定t-mAb的必要性¹。 此外，随着市场上一些前沿mAb的专利到期，生物类似药也越来越普遍。具体而言，目前市场上已经有五种以上的IFX生物类似药。

配体结合试验是最早用于测定mAb浓度的方法，并很快成为了临床实验室测定mAb的优选技术。然而，LBA有一些缺点，例如试剂批次间差异性会导致重现性不佳，而且各种商业化方法之间也不统一²。 为突破这些限制，有研究人员开发出了替代技术，基于LC-MS的方法就是其中之一，现在已经有实验室采用该技术分析小分子。尽管蛋白质组学领域已经为蛋白质水平的分析开发出了很成熟的LC-MS/MS特征性肽段分析方法，但这种方法尚未在临床环境的t-mAb常规定量分析中广泛应用。这主要是因为蛋白质LC-MS/MS测定领域缺少易于实施的商业化解决方案。

使用LC-MS/MS和mAbXmise试剂盒测定IFX

IFX是一种成熟的t-mAb，用于治疗炎症性肠病。据文献报道，已经有人成功开发出了测定IFX的LC-MS/MS方法^3,4,5,6。 这些方法通常采用LC-MS/MS仪器对特征性胰蛋白酶解肽进行质谱检测，以测定t-mAb的浓度，选择性良好，且因此可在较宽的动态范围内精密准确地分析IFX。最近市面上出现了用于制备LC-MS分析血浆/血清样品的即用型LC-MS试剂盒，这无疑是拓宽LC-MS方法在mAb测定中的应用范围的重要一步。使用市售LC-MS试剂盒可以优化LC-MS/MS LDT方法的日间重现性和适用性，举个例子，Promise Proteomics mAbXmise这款试剂盒使用全长同位素标记mAb (SIL-mAb)作为内标，能够可重现、稳健且准确地定量mAb⁴。 此外，试剂盒还提供了批次间重现性有保障的标准品、质控样品(QC)、试剂和消耗品，有助于统一不同LC-MS平台的方法，便于不同实验室采用。

使用特征性肽段分析方法，再结合Promise Proteomics mAbXmise样品前处理消耗品，可通过测定特征性胰蛋白酶解肽来测定IFX，并且在包括样品前处理、色谱分离和多重反应监测(MRM)质谱检测在内的每个环节都保证方法的选择性。

使用Promise Proteomics mAbXmise试剂盒进行样品前处理

按照mAbXmise使用说明(IFU)制备LC-MS/MS分析的样品。英夫利昔单抗的定量工作流程如图1所示。该工作流程包括以下步骤：

1.样品前处理：将20 µL血浆样品（包括校准品和质控样品）分配到装有冻干稳定标记英夫利昔单抗的mAbXmise样品板中。

2.样品纯化：将样品转移到PuriXmise板上进行英夫利昔单抗的免疫捕获，然后清洗样品以减少基质干扰物。将样品洗脱到收集板中，然后挥干。

3.样品酶解：重悬样品，然后加入蛋白酶(CutXmise)过夜酶解英夫利昔单抗。淬灭酶解反应后，样品即可进行分析。

4. LC-MS分析：将样品进样至LC-MS仪器中进行分析，检测标记和未标记的肽。英夫利昔单抗及其SIL标准品的肽通道如表1所示。

使用mAbXmise试剂盒提供的校准品、QC样品和内标进行性能论证，其中校准品的浓度在2~100 μg/mL范围内，QC样品的浓度在4~25 μg/mL范围内。此外，我们还分析了29个IFX血浆样品，并比较了分析测得的不同IFX特征性肽段的浓度。

LC-MS/MS分析

样品进样至ACQUITY UPLC™ I-Class FL系统，在XSelect™ Premier HSS T3, 2.1 mm x 50 mm, 2.5 µm色谱柱上使用乙腈/水/甲酸梯度进行分离，运行时间为4.5 min，然后由Xevo™ TQ-XS质谱仪进行检测。另使用相同的设置和Xevo TQ-S micro质谱仪重新分析了样品。本次分析采用的特征性肽段MRM通道见表1。

分析灵敏度和标曲线性

本研究测定了IFX的多个特征性胰蛋白酶解肽，发现无论使用Xevo TQ-XS还是Xevo TQ-S micro质谱仪，2 μg/mL IFX校准标准品中分析灵敏度最高的肽都是SINSATHYAESVK (SIN)，其次是ASQFVGSSIHWYQQR (ASQ)，它们具有最高的峰响应和信噪比(S/N)。所有肽的S/N (PtP)均大于10:1，表明这些肽适合用作浓度为2 μg/mL的英夫利昔单抗的LOQ。研究发现，在两种系统上得到的每一种肽的标准曲线均呈线性，r²>0.998。

精密度

使用试剂盒提供的QC样品（4 μg/mL和25 μg/mL）重复进样五次，评估在Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S micro上运行该方法的精密度。IFX特征性肽段在各QC浓度下的总精密度为CV≤9.5%，与IFX标示浓度相比的准确度在95%~108%范围内（表2）。这些数据证明试剂盒和LC-MS/MS系统具有良好的日内重现性。

肽段比较

本研究对29份IFX血浆样品进行了LC-MS/MS分析，以比较IFX的不同特征性胰蛋白酶解肽。图3展示了Xevo TQ-XS分析中观察到的各种IFX特征性肽段之间的差异，其中SIN肽段的浓度低于样品中的其他肽段。29个样品中，这五种肽段的平均重现性(CV 29%)远高于除SIN外其他四种肽段的平均重现性(CV 10%)。

IFX SIN肽段浓度较低的可能原因是这种肽段容易发生脱酰胺作用，在纯血浆样品中，天冬酰胺-丝氨酸(N-S)基序处的脱酰胺作用会导致其分子量增加0.98 Da，使得指定MRM通道可检测的IFX SIN未标记肽段减少，而加标分析物的校准品和QC样品并不能补偿这部分肽段⁷。 基于这些数据和支持信息，建议实验室在使用该方法时先做评估，正确选择适用于定量英夫利昔单抗的肽段。

如今，临床研究领域已经有了使用LC-MS/MS技术定量治疗性mAb的解决方案。本应用简报介绍了定量血浆中英夫利昔单抗的一个实例，该方法先用市售试剂盒进行样品前处理，然后进行LC-MS/MS分析。

Promise Proteomics mAbXmise试剂盒降低了分析门槛，使分析变得易于实施，同时还可以实现自动化。可测定范围扩展为2~100 µg/mL，不会像免疫分析法那样不时需要稀释样品，缩短了分析高浓度样品的周转时间。此外，减少稀释和重新分析需求还提高了试剂盒的利用率，有助于成本管理。这款试剂盒有助于提高IFX免疫捕获和胰蛋白酶酶解的日间重现性，以便正确选择肽段用于靶向LC-MS/MS分析。与直接酶解特征性肽段工作流程相比，该试剂盒的流程能减少基质干扰，提高分析灵敏度，所需的样品量也更少。

本研究证明，该方法可在Xevo TQ-XS和Xevo TQ-S micro质谱仪上运行，且二者能够在预期的动态范围内定量IFX，选择性和分析灵敏度俱佳，适用于定量血浆样品中的低浓度IFX特征性肽段。

1. Hirsch I, Goldstein DA, Tannock IF, Butler MO, Gilbert DC.Optimizing the dose and schedule of immune checkpoint inhibitors in cancer to allow global access.Nat Med. 2022 Nov;28(11):2236–2237.doi: 10.1038/s41591-022-02029-1.PMID: 36202999.
2. Hoofnagle AN, Wener MH.The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.J Immunol Methods.2009 Aug 15;347(1–2):3-11.doi: 10.1016/j.jim.2009.06.003. Epub 2009 Jun 16.PMID: 19538965; PMCID: PMC2720067.
3. Tron C, Lemaitre F, Bros P, Goulvestre C, Franck B, Mouton N, Bagnos S, Coriat R, Khoudour N, Lebert D, Blanchet B. Quantification of infliximab and adalimumab in human plasma by a liquid chromatography tandem mass spectrometry kit and comparison with two ELISA methods.Bioanalysis.2022 Jun;14(11):831–844.doi: 10.4155/bio-2022-0057.Epub 2022 Jun 23.PMID: 35735172.
4. Jourdil JF, Lebert D, Gautier-Veyret E, Lemaitre F, Bonaz B, Picard G, Tonini J, Stanke-Labesque F. Infliximab quantitation in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: towards a standardization of the methods? Anal Bioanal Chem.2017 Feb;409(5):1195–1205.doi: 10.1007/s00216-016-0045-4.Epub 2016 Nov 8.PMID: 27826630.
5. El Amrani M, van den Broek MP, Göbel C, van Maarseveen EM.Quantification of active infliximab in human serum with liquid chromatography-tandem mass spectrometry using a tumor necrosis factor alpha -based pre-analytical sample purification and a stable isotopic labeled infliximab bio-similar as internal standard: A target-based, sensitive and cost-effective method.J Chromatogr A.2016 Jul 8;1454:42-8.doi: 10.1016/j.chroma.2016.05.070. Epub 2016 May 22.PMID: 27264745.
6. Willrich MA, Murray DL, Barnidge DR, Ladwig PM, Snyder MR.Quantitation of infliximab using clonotypic peptides and selective reaction monitoring by LC-MS/MS.Int Immunopharmacol.2015 Sep;28(1):513-20.doi: 10.1016/j.intimp.2015.07.007. Epub 2015 Jul 25.PMID: 26210595.
7. Sydow JF, Lipsmeier F, Larraillet V, Hilger M, Mautz B, Molhoj M, et al. Structure-based prediction of asparagine and aspartate degradation sites in antibody variable regions. PloS one. 2014;9(6):e100736.

特别说明

本应用简报仅供研究使用，不适用于诊断。

在欧洲，mAbXmise试剂盒是供专业实验室使用的体外诊断医疗器械。mAbXmise试剂盒可测定血浆中的单克隆抗体浓度。分析性能取决于仪器特性及其设置。用户应按照内部规范要求验证分析方法。请参阅各自专属说明以获取更多信息。PROMISE蛋白质组学产品在全球均有销售，产品在各国家/地区的用途、应用和供应情况取决于当地法规注册状态。未注册的产品和所有其他产品仅供研究使用。制造商：PROMISE PROTEOMICS SAS 7, parvis Louis Néel • 38040 Grenoble France • Phone +33 4 38 02 36 50 • contact@promise-proteomics.com • RCS Grenoble B 433 546 504