使用BioAccord™ LC-MS系统对生物治疗药物电荷异构体进行在线AEX-MS分析

生物治疗药物电荷异构体的表征和监测对于确保产品的一致性和稳定性至关重要。电荷异构体(CV)通常使用制备型离子交换色谱(IEX)进行分析，然后进行后续的分离和反相液相色谱和质谱(LC-MS)分析。这是一个漫长、技术难度大且耗时的过程。因此，开发一种在线电荷异构体分析方法非常有必要。虽然已有研究将阴离子交换色谱与非变性质谱联用(AEX-MS)以研究阴离子蛋白质，但为研究生物治疗药物开发的方法仍非常有限。本研究介绍了一种稳定、可重现的阴离子交换质谱(AEX-MS)方法，使用配备ACQUITY™ Premier UPLC™的BioAccord™ LC-MS系统分析电荷异构体。使用该方法对带电物质进行色谱分离，然后使用waters_connect™ INTACT Mass应用程序进行定性和定量。针对AEX-MS分析的流程中样品开发的工作流程速度非常快，并且可以轻松引入LC-MS知识或实践经验有限或缺乏的实验室。

优势

• 通过AEX-MS进行在线分析，无需耗时的传统分离方法
• 本文介绍的工作流程可以轻松适应非MS专家进行快速分析

生物治疗药物通常是复杂的大分子，存在着大量的微异质性，并受多种降解途径的影响，其中包括翻译后修饰(PTM)，这种修饰通常会导致生物治疗药物产生电荷异构体(CV)。由于这些异构体可能对药物的效价和疗效产生影响，因此被视为关键质量属性(CQA)。因此，在整个工艺开发和药品生产过程中准确、快速地监测CV是非常重要的。

离子交换色谱(IEX)通常是分析电荷异构体的首选方法。在这类方法中，溶质分子将可逆地吸附到带相反电荷的树脂上。电荷异构体的保留时间取决于每种异构体与色谱树脂之间相对于其他物质的相互作用。树脂或者带负电荷，通过阳离子交换色谱(CEX)交换正离子，或者带正电荷，通过阴离子交换色谱(AEX)交换负离子。洗脱使用盐梯度或pH梯度进行，但由于pH梯度在重现性和可控性方面的挑战，盐缓冲液的使用更为普遍。

质谱(MS)为深入了解生物治疗药物电荷异质性的生化基础提供了重要信息。通常情况下，采用IEX进行离线分离，然后进行缓冲液置换和后续的LC-MS分析，已被证明是解析每种电荷异构体性质的有效方法。然而，这个过程速度慢、通量低，并且容易形成干扰。因此，将IEX直接与质谱仪联用，可以为电荷异构体鉴定提供一种更为简单且通量更高的方法。然而，这种方法也存在一些问题。IEX分离通常在流动相中使用非挥发性盐，这与质谱法不兼容。对于直接的IEX-MS分析，必须使用挥发性盐，而挥发性盐的缓冲能力较低，因此色谱分离质量可能较差。此外，与MS分析中常用的变性溶剂相比，这些缓冲液产生的信号强度通常较低，给丰度较低的物质定性带来了挑战。尽管存在这些挑战，非变性质谱法仍然为蛋白质结构提供了独特的信息，例如根据电荷分布区分结构异构体的能力。

最近，通过BioAccord LC-MS系统进行的在线CEX-MS分析已被用于鉴定单克隆抗体(mAb)电荷异构体。尽管大多数市售治疗性mAb具有碱性等电点(pI)，但具有较低pI值的生物治疗药物市场正在迅速扩大，它们更适合使用阴离子交换方法进行分析。

本应用纪要进一步强调了BioAccord LC-MS系统在生物治疗药物表征方面的适用性，并介绍了一种鉴定电荷异构体的简单、高通量的在线AEX-MS方法。

样品信息

生物药物A使用药学相关缓冲液配制，浓度约0.2 mg/mL。样品使用0.22 µm旋转过滤器过滤，然后直接转移到HPLC样品瓶中。所有样品在分析之前储存在预先冷却至+5 ℃的进样架中。

液相色谱分析

评估阴离子交换方法的第一步是确定分析的最佳柱温。本研究使用的LC参数在表1中以梯度A显示，在各运行之间保持不变。研究中评估了20 °C、25 °C、30 °C和35 °C这四种不同柱温对色谱峰分离的影响。

图1展示了在上述各条件下分析的生物治疗药物A的AEX荧光色谱图。在20 °C下，可以清晰地区分六个色谱峰。在25 °C下，观察到相同的六个峰，且色谱质量相当。相比之下，在30 °C下，峰2的分离效果较差，且无法区分峰6。这一趋势在35 °C下继续存在，此时峰1和峰3之间的基线显著升高，以至于峰2不再可见。这些数据表明，20 ℃或25 ℃的柱温适用于该方法。随后对三种不同的色谱梯度进行了评估。这些梯度在表1中汇总为梯度A、B和C。

图2展示了使用表1中所述的梯度A、B和C通过AEX方法分析生物治疗药物A得到的AEX荧光色谱图。梯度A表现出较高的色谱分离度，在主洗脱峰的右侧出现几个代表酸性异构体的峰。梯度B也提供了良好的分离度，但相较使用梯度A时，质量略有下降。相比之下，梯度C的分离度较差，可区分的峰较少。结果表明，梯度可以轻松针对特定分子进行调整。 

为了监测蛋白质洗脱流动相梯度的pH，使用与梯度A中所述相同的流动相和色谱柱，在ÄKTA Pure™ 25快速高效色谱仪器(FPLC)上加载，并连续监测pH。考虑到系统压力限制，本示例中采用的流速为0.1 mLmin^-1。图3显示，pH的下降不呈线性，而是在运行过程中急剧下降。当超出乙酸铵的缓冲能力时，就会发生这种情况。这凸显了使用pH梯度时控制蛋白质洗脱的难度。除了这些参数之外，研究中还对方法进行了其他优化，包括在进样前将样品通过缓冲液交换进入流动相A中、降低流动相B的pH值，以及延长LC运行时间，但是，这些变化并没有在色谱分离度上观察到任何差异

质谱

为确定使用该溶剂体系进行在线MS分析的最佳条件，我们在不同的锥孔电压(100~160 V)和脱溶剂气温度（350、450和550 °C）下进样了生物治疗药物A（分子量约为75,000 Da）。使用UNIFI应用程序计算洗脱峰中洗脱产物的平均质谱信号，并记录丰度最高的电荷态强度。图4展示了该强度针对各测试锥孔电压和脱溶剂气温度所绘制的图。脱溶剂气温度对质谱数据的质量有重要影响，在550 °C下观察到最高的MS1强度。锥孔电压对信号的影响较小，但在各脱溶剂温度下，约在140~160 kV下达到最高。因此，研究中选择550 °C和150 kV作为理想条件。值得注意的是，本研究选择的理想条件与相应的CEX-MS应用纪要中列出的脱溶剂条件不同，后者选择了350 ^oC。除了在550 °C下强度的提高以外，其他MS谱图保持不变。

BioAccord系统的主要优势之一是该系统可以交由非专家用户操作。本研究使用该系统，通过AEX-MS快速分析了一组工艺支持样品，此前已进行过AEX-UV分析。

工艺开发部门提供了四个样品，其中生物治疗药物A已经在纯化的pH条件下（6、7、8.2和9）进行了纯化。使用之前部分中开发的优化参数通过AEX-MS分析样品。图5a展示了在pH 6的条件下纯化样品的总UV (TUV)色谱图。根据随后的去卷积质谱数据，可以明显观察到四个色谱峰。它们的保留时间分别为约26.9 (1)、27.4 (2)、27.9 (3)和28.5 (4) min。图5b展示了峰1的平均质谱信号。相关电荷态分布估计在约2000~5000 m/z之间，突出显示了每个峰对应的电荷态。值得注意的是，由于蛋白质的部分展开，可以观察到同一物质的两个电荷态包络。经过去卷积处理后的MS数据如图5c所示。数据表明，色谱图中该峰对应的物质与未修饰的生物治疗药物A的理论质量数一致。接下来，对峰2下的质谱信号（图5d）进行去卷积（图5e）。其中，基峰对应的是带有二羟基咪唑啉加合物的生物治疗药物A的质量数。这是一种常见的酸性修饰，在生物治疗药物中发生在精氨酸残基上，主要发生在包涵体的生成过程中。因此，必须通过生长条件或下游纯化来实现控制。实验还分析了峰3和4的质谱数据（见图5f-i）。结果表明，这些峰的主要物质为生物治疗药物A的糖基化和磷酸葡糖酰基化化合物。这两种修饰均为酸性修饰，并且在之前使用不同分析的研究中曾在生物治疗药物A中观察到这两种修饰。总而言之，我们能够为AEX色谱图中每个峰的指配带电物质。 

随后，为评估每种修饰的相对丰度，使用waters_connect INTACT Mass应用程序处理AEX-MS数据。表2展示了软件的直接输出，其中使用每个样品中每种离子的总MS信号，列出了每种PTM对产品异质性的影响。此外，使用该软件可以自动、正确地归类每个UV峰，无需定量分析。输出结果表明，洗脱pH值较低时，产物的异质性最小。

工艺开发样品2

工艺开发部门另外提供了9个样品，均为在不同系统和不同条件下纯化的生物治疗药物A。首先，在不同的pH条件下（pH 5.7、5.9、6.3和6.7），同时也使用不同的α/β包涵体比率，其中100%是按照工艺转换的标准量。图6a展示了样品的荧光色谱图。目视检查色谱图，其中展示了在各电荷异构体水平上的轻微差异，尤其是pH 6.7的洗出液，表明产物的均质性更高。每个AEX-MS数据集均在waters_connect INTACT Mass应用程序中处理，该应用程序会在数据采集后立即归类色谱图上的峰。表3展示了每个样品的PTM水平报告。输出数据显示，产品异质性与洗脱pH值在5.7~6.7之间的相关性逐渐增加。所得数据进一步表明，α/β比率与PTM水平之间无明显相关性。

AEX-MS是一种新兴的生物制药检测方法，可分析电荷异构体。本研究使用BioAccord LC-MS系统成功实施了在线AEX-MS方法。BioAccord LC-MS系统能够为带电物质提供稳定的色谱分离，并提供高质量的质谱图，有助于鉴定每个色谱分离的峰。通过waters_connect INTACT Mass应用程序进行数据采集和分析，即使是对于没有质谱分析经验的用户而言，也是一种简单、稳定的方法。

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