• 应用纪要

Gen-Pak™ FAX色谱柱的性质及其在大分子生物制剂阴离子交换分析中的应用

Gen-Pak™ FAX色谱柱的性质及其在大分子生物制剂阴离子交换分析中的应用
  • Susan C. Rzewuski
  • Matthew A. Lauber
  • Szabolcs Fekete
  • Waters Corporation
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摘要

随着基于蛋白质和核酸的治疗手段不断涌现，我们需要改进离子交换方法，以确认原料药和药品中所含成分的浓度、完整性和相对丰度。

研究发现，一种弱阴离子交换色谱柱（称为Gen-Pak FAX色谱柱）在各种蛋白质和寡核苷酸的分离中表现出相对较低的保留性和较高的动力学效率。与其他强阴离子交换色谱柱比较测试后，Gen-Pak FAX表现出其色谱柱填料的独特性。本研究发现，使用Gen-Pak FAX色谱柱时，固定相膨胀不那么明显，因此可以更轻松地应用高流速和低离子强度的流动相。此外，Gen-Pak FAX色谱柱的独特洗脱行为让开发新的分离条件成为可能，从而能够实现对寡核苷酸杂质分离的出众选择性。

优势

  • 提高小分子寡核苷酸和示例中性pI蛋白质的峰容量
  • 柱压更低，有助于实现更高的流速和更高的分析通量
  • 低保留性和独特的选择性有助于实现全新的分离

简介

生物聚合物（即肽、蛋白质、寡核苷酸和大分子核酸），由于其固有的电荷带电性质，因此是离子交换(IEX)分离的理想底物。序列、翻译后修饰、分子长度以及各种构象异构体和异构体的存在可能与总净电荷的差异相关联。因此，可以通过生物分子与带电固定相的静电相互作用来有效分离这些生物分子。由于IEX通常具有温和、非变性的洗脱条件，因此常在生产工艺中用于纯化各种类型的生物制剂。

由于IEX能够精细地分辨表面电荷差异，因此它也成为了监测治疗性蛋白质电荷异构体和治疗性寡核苷酸杂质的理想分析工具1,2,3,4,5。

大多数市售治疗性单克隆抗体(mAb)的等电点(pI值)都大于8。因此，阳离子交换剂(CEX)常用于mAb电荷异构体分析6。 但是，IgG4亚类mAb（例如那他珠单抗）的pI往往较低，因此可能适合通过阴离子交换(AEX)色谱法进行分析7。 因此，需要评估阴离子交换吸附剂的蛋白质分离能力。随着CRISPR技术的出现，用户需要为Cas核酸酶和核糖核蛋白复合物开发新的分析技术。AEX可能也有助于这类蛋白质材料的分析。

同样重要的是，AEX色谱柱可能有助于寡核苷酸和核酸分析。这类生物分子的糖-磷酸盐骨架中含有磷酸基团，因此带负电荷(pKa1 = 2.14)。AEX已被应用于合成DNA、RNA、天然产物和质粒的纯化和分析8,9,10。 延长链上每增加一个核苷酸，核酸就会多带一个负电荷，这会直接增加AEX的保留性。因此，理论上，AEX应能够对长度不同的寡核苷酸产生选择性11。 尽管有望达到这种选择性，但一些分析级AEX方法由于分析物回收率不佳和残留效应高而缺乏稳定性。我们最近提出了改善AEX分离的新方法注意事项5。 其中一个主要的注意事项是使用弱AEX固定相而非强交换剂。在上样时，由于溶质与固定相官能团之间固有的较弱结合强度，特别是在可以优化调节流动相pH的情况下，使用弱交换剂可能会提高回收率5。 我们在研究中发现，固定相保留性与大分子核酸的回收率和残留之间存在相关性。

在本应用纪要中，我们选择考察Gen-Pak FAX色谱柱的特性，因为它最近在现代方法开发实验中显示出良好的潜力。尽管Gen-Pak™ FAX色谱柱是沃特世在90年代初期首次推出的，但它基于2.5 µm无孔聚合物颗粒技术至今仍可带来优势。   

本文讨论了使用Gen-Pak FAX色谱柱实现的三个示例分离，及其在生物聚合物分析中的应用，包括(1) IgG4 mAb，(2) 15~35 mer寡核苷酸dT ladder和(3) 反义寡核苷酸的模型混合物。

实验

那他珠单抗和寡核苷酸Ladder的LC分析

样品前处理
那他珠单抗(6 mg/mL)取自过期的Tysabri™那他珠单抗（Biogen，美国马萨诸塞州剑桥），用水稀释至1 mg/mL，直接进样分析，无需进一步前处理。将一瓶MassPREP™寡核苷酸标准品（P/N：186004135）内容物复溶于100 μL水中，制备寡核苷酸dT ladder。

流动相制备
用于那他珠单抗和寡核苷酸dT ladder分析的三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和氯化钠(NaCl)购自Sigma-Aldrich（瑞士布克斯）。将Tris缓冲液制备为20 mM溶液，pH调节至约8.0，该20 mM Tris缓冲液用作流动相A。将NaCl溶于20 mM Tris缓冲液中（最高600 mM），制得流动相B。

液相色谱条件

液相色谱系统：

配备四元溶剂管理器的ACQUITY™ UPLC ™ H-Class Bio系统[相当于配备QSM FTN仪器的ACQUITY Premier系统，并配置高pH试剂盒]

检测：

ACQUITY TUV检测器（钛合金流通池，5 mm，1500 nL）

波长：

260 nm或280 nm

数据采集：

Empower™ Pro 3软件Feature Release 3

色谱柱：

Gen-Pak FAX色谱柱(WAT015490)；4.6 × 100 mm

注：其他类型的色谱柱均配置4.6 × 50 mm规格。Gen-Pak FAX色谱柱固定相以匹配的4.6 × 50 mm配置填充，进行对比测试。

柱温：

30 °C

样品温度：

6 °C

样品管理器清洗液：

18.2 MΩ水

密封清洗液：

10 % HPLC级甲醇/90% 18.2 MΩ水(v/v)

进样体积：

1 µL

流速：

那他珠单抗和寡核苷酸dT ladder分离：0.72 mL/min

流动相：

那他珠单抗和寡核苷酸dT ladder的分离：

20 mM Tris pH 8.0缓冲液。盐梯度(NaCl)信息见图片说明。

注射器吸取速度：

30 µL/min

进样针位置：

1.0 mm

TUV采样速率：

2 Hz

滤波器时间常数：

无

结果与讨论

一般注意事项

分析型阴离子交换最好使用无孔树脂进行。尽管无孔颗粒的结合能力有限，但由于生物分子的扩散性低且静电相互作用强，无孔颗粒在进行高分辨率分析时更受青睐。无孔颗粒有助于大幅减少与传质相关的谱带展宽。决定AEX固定相分离能力的主要因素通常是它的接枝情况（或用于引入带电荷键合相的表面组成）。

如前文所述，沃特世在90年代初首次推出了专门针对寡核苷酸的GenPak FAX色谱柱。我们发现它非常适合许多当今的新方法。

在过去的一些研究工作中，我们团队比较了4.6 × 50 mm色谱柱规格的不同树脂。我们将Gen-Pak FAX色谱柱固定相与其他两种市售SAX树脂一起进行了测试，其中一种采用4 µm无孔颗粒，另一种采用3 µm无孔颗粒。通过保持相同的固有梯度倾斜度，对不同AEX色谱柱的分离质量进行了比较测量。   

分析IgG4 mAb（那他珠单抗）

首先测试色谱柱分离蛋白质样品的能力。选择那他珠单抗，因为它是一种中性pI mAb，适用于AEX模式下的分离。

本研究考察了每种固定相的分离能力和保留性。采用pH 8的Tris系统获得的电荷异构体色谱图如图1所示。首先要注意的是，两根强AEX色谱柱的保留性明显强于弱离子交换Gen-Pak FAX色谱柱。

图1.pI约7.8的单克隆抗体（那他珠单抗）获得的UV色谱图(280 nm)，其中展示了三种不同AEX固定相分离酸性和中性pI蛋白的适用性。盐梯度分离在30 ˚C下进行，流动相由20 mM Tris pH 8缓冲液组成，流速0.72 mL/min，NaCl梯度为10分钟从0增加至200 mM。

这种较低的保留性可能是有利的，也可能是不利的，具体取决于分析的需要。我们经常发现，IEX方法在很大程度上仍然基于经验性观察（试错法）。因此，工具箱中配备多种工具（弱AEX色谱柱和强AEX色谱柱）是非常有价值的。

图1显示，采用Gen-Pak FAX色谱柱观察到的主要异构体峰最尖锐，且分离度（即主峰与右侧肩峰的变异体之间）最高。弱离子交换柱的峰谷比为p/v = 3.97，强离子交换柱的峰谷比为2.86和2.19。

色谱柱产生的压力是IEX中一个值得注意的方法参数。在大分子的IEX中，压力可能会影响分离效率以及选择性和总体保留性13,14。 在大多数液相色谱模式中，固定相的孔隙率被假设为恒定且与流动相组成无关。但是，众所周知，离子交换固定相在缺乏盐（或足够的离子强度）的情况下会膨胀，而且最近还发现了所谓的润湿/去润湿过程，证明色谱柱孔隙率取决于所应用的色谱条件15,16,17,18。 IEX相的溶胀通常表现为压力增加（色谱柱渗透性降低）和色谱柱表观孔隙率的变化。因此，普遍建议使用离子交换色谱柱，且流动相中至少含0.02 M的缓冲液19。

研究中记录了每根色谱柱产生的最大反压，结果见图2。两根SAX色谱柱表现出非常相似的高反压。离子强度较低的流动相通过IEX色谱柱时几乎总是会观察到较高的压力。接枝的渗透性是造成这一现象的主要决定因素之一。不同的接枝组成和厚度与不同的压力效应相关13。 请注意，Gen-Pak FAX色谱柱表现出明显更高的渗透性和相应更低的压力。因此，分析人员可以在离子强度较低的流动相中使用Gen-Pak FAX色谱柱，而不必担心膨胀和增压问题。分析人员还可以使用Gen-Pak FAX色谱柱固定相更轻松地调整高流速、高通量方法。

图2.在30 °C、0.72 mL/min流速、20 mM Tris pH 8缓冲液流动相和10 min梯度（NaCl范围为0~200 mM）下进行的盐梯度分离，采用不同AEX固定相的三根4.6 × 50 mm色谱柱观察到的最大柱压。

15到35 mer寡核苷酸dT ladder的分离

研究中实施了类似的实验，以比较15~35 mer寡核苷酸dT ladder内的一组关键分析物对。使用第一个和最后一个保留时间作为分离窗口，计算每组峰轮廓的有效峰容量。Gen-Pak FAX色谱柱颗粒再次与两种SAX固定相进行了比较（图3）。请注意，Gen-Pak FAX色谱柱的保留性仍然较低，但对于这些小分子寡核苷酸，其峰容量(Pc)相当甚至更高。Gen-Pak FAX色谱柱的Pc = 98，而两根SAX色谱柱的Pc = 97和75。Gen-Pak Fax色谱柱的运行压力仍然远低于SAX固定相（几乎降低为三分之一）。 

图3.使用不同4.6 × 50 mm AEX色谱柱获得的寡核苷酸 dT ladder UV色谱图(260 nm)。盐梯度分离在30 ˚C下进行，流动相由20 mM Tris pH 8缓冲液组成，流速0.72 mL/min，NaCl梯度10分钟从300增加至600 mM。

反义寡核苷酸模型混合物的分离

最近，研究人员Stilianos Roussis和Claus Rentel发表了一种用于反义寡核苷酸(ASO)杂质分析的新方法12。 他们一直在寻找一种可提供新型选择性并且有助于检测脱氨基杂质的分离方法。在测试的色谱柱中，Gen-Pak FAX色谱柱被发现适用于特别设计的流动相条件。研究发现，一种含75%甲醇的理想洗脱液对寡核苷酸具有独特的选择性。由于溶解度问题，这种新条件限制了洗脱液中的盐浓度。在洗脱液中还同时使用了250 mM的溴化钠和胍。Gen-Pak FAX色谱柱固定相的低保留性有助于这一特定方法的开发。本研究的作者得出结论，弱AEX色谱柱（Gen-Pak FAX色谱柱）最显著的优势是它能够兼容高有机相含量、低盐含量的流动相进行洗脱。这些创新的AEX条件避免了不必要的疏水、极性/亲水和氢键相互作用，并尽可能地利用单一离子/静电分离机制。作者观察到，色谱柱对硫代磷酸酯(PS)寡核苷酸杂质的分离性能改善主要基于离子/静电差异。

据报道，所述的分离还得益于与固定相的静电势和分析物离子化相应的pH梯度效应。与SAX色谱法相比，这种新的WAX方法实现了更出色的分离度。这是首次通过液相色谱直接确定硫代磷酸寡核苷酸的脱氨程度。

图4展示了采用全新的选择性方法进行ASO杂质分析的示例。请注意，离子对反相(IP-RP)色谱法无法实现此类分离。因此，弱AEX和IP-RP模式都可用于对寡核苷酸进行全面、互补的分析。

图4.使用Gen-Pak FAX色谱柱获得的寡核苷酸模型混合物UV色谱图。洗脱液：含5 mM Na3PO4、250 mM NaBr、250 mM GnDCl的75%甲醇溶液。已获得参考资料使用许可12。

结论

这篇简报回顾文档兼应用纪要展示了一些有效应用弱阴离子交换Gen-Pak FAX色谱柱优势的精选示例。对于各种蛋白质以及寡核苷酸/核酸的分离，Gen-Pak FAX色谱柱的保留性低于强固定相AEX色谱柱。这种低保留性可能带来诸多益处，尤其是在流动相pH可以优化调整的情况下。

由于溶质和固定相之间发生的固有相互作用较弱，因此分离效率得以显著提高。与其他SAX色谱柱相比，使用Gen-Pak FAX色谱柱观察到的那他珠单抗和15到35 mer寡核苷酸dT ladder的峰容量更高。其他研究也发现该色谱柱的低保留性对于大分子核酸分析（即完整mRNA）有益，可改善溶质回收率和方法稳定性5。

Gen-Pak FAX色谱柱也表现出良好的渗透性。由于它表现出明显更高的渗透性，分析人员可以在离子强度较低的流动相中使用该色谱柱，而不必担心膨胀和增压问题。这种高渗透性还支持高流速运行，助力开发出高通量方法。   

最后，Gen-Pak FAX色谱柱的低保留性激发了人们开发出新型的AEX方法，该方法将高有机相比例（甲醇高达75%）的洗脱液与NaBr和胍相结合，实现了新的选择性。研究人员提出，在这些条件下可以尽量减少非特异性相互作用，尽可能地促进了基于静电相互作用的分离机制。

Gen-Pak、ACQUITY、MassPREP、UPLC和Empower是沃特世公司的商标。Tysabri是Biogen MA Inc的商标。

参考资料

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