使用配备Atlantis™ Premier BEH™ C₁₈ AX色谱柱的Arc™ Premier系统对亚硝酸盐和硝酸盐进行可靠的LC/UV分析

研究认为亚硝酸盐和硝酸盐可作为前体物质形成有致癌性的亚硝胺杂质。本文介绍了一种使用配备UV检测器和Atlantis Premier BEH C₁₈ AX色谱柱的Arc Premier系统分析亚硝酸盐和硝酸盐的反相方法。该方法直接进样，省去了分析之前的衍生化步骤。亚硝酸盐和硝酸盐的定量限(LOQ)分别为0.025 µg/mL和0.075 µg/mL。该方法表现出优异的重复性、精密度和线性，适用于测定聚乙烯吡咯烷酮(PVP)辅料中的亚硝酸盐和硝酸盐，定量性能准确，回收率可达91%~100%。 

优势

• 使用Atlantis Premier BEH C₁₈ AX色谱柱在反相条件下成功保留亚硝酸根和硝酸根离子
• 直接进样、快速简单的筛查方法，分析之前无需进行复杂的样品衍生化步骤

亚硝酸盐和硝酸盐是土壤、水、空气和植物中天然存在的含氮化合物¹。 保存食品、生产某些药物以及炸药时也会用到这类物质¹。 最近有文献指出，亚硝酸盐和硝酸盐是形成N-亚硝胺化合物（潜在的人类致癌物）的前体或亚硝化剂^2-6。 亚硝胺的形成方式通常是药品生产过程中活性药物成分(API)中的仲胺或叔胺与残留的亚硝酸盐发生反应。硝酸盐在一定条件下可以被还原为亚硝酸盐，因此也被视为一种亚硝化剂⁴。 制剂成分（包括辅料）可能含有亚硝化前体，进而导致药品中产生亚硝胺污染物⁴。

目前应用较为广泛的硝酸盐和亚硝酸盐测定方法包括离子色谱(IC)法（使用电导检测器）、液相色谱(LC)法（使用UV检测器）以及Griess显色法^4-6。 这些方法虽然有效，但每次只能测定一种亚硝酸盐或硝酸盐，而且通常需要不同的样品前处理步骤。Griess显色法是检测亚硝酸盐的专属方法，无法测定硝酸盐含量⁴。 考虑到硝酸盐还原后可转化为亚硝酸盐，测定这两种化合物都很有必要。

本文介绍了一种采用紫外检测器通过直接进样法一并分析亚硝酸盐和硝酸盐的液相色谱(LC)方法。这种反相方法可以简单快速地筛查聚乙烯吡咯烷酮辅料中的亚硝酸盐和硝酸盐。

高纯度LC/MS级乙腈、甲酸铵和甲酸购自Fisher Chemicals。分析级硝酸钠(NaNO₃)和亚硝酸钠(NaNO₂)购自Sigma。聚乙烯吡咯烷酮(PVP) K 15购自Sigma。

标准品溶液

将亚硝酸钠和硝酸钠盐溶于水中，制成5.0 mg/mL的亚硝酸盐和硝酸盐储备液。用水稀释储备液，制成含有0.1 mg/mL亚硝酸盐和硝酸盐的混标溶液。用水稀释混标溶液，制成标准曲线样品。 

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)样品溶液

用水制备浓度为1 mg/mL的测试样品溶液，然后超声处理20 min使其充分溶解。萃取完成后，样品溶液在3000 rpm下离心10 min，接着使用PVDF 0.2 µm针式过滤器（P/N：WAT200806）过滤，然后进行分析。

使用Empower软件采集和分析数据。使用Empower项目提供的报告模板生成汇总报告。

在方法开发过程中，为确保亚硝酸盐和硝酸盐成功实现色谱保留和分离，我们考察了多种色谱柱填料、有机溶剂、流动相添加剂和pH。Atlantis Premier BEH C₁₈ AX色谱柱在反相条件下成功保留并分离了亚硝酸盐和硝酸盐（图1A）。0.1 µg/mL标准品的重复进样结果表明Arc Premier系统分析亚硝酸盐和硝酸盐的重复性非常出色，峰面积相对标准差(RSD)分别为0.94%和3.06%（图1B）。 

检测限和定量限（LOD和LOQ）

本研究以信噪比(S/N)大于3:1和10:1为标准确定该UV方法能可靠检出和定量亚硝酸盐和硝酸盐的最低浓度水平。信噪比的计算方法是使用Empower软件比较标准品溶液中亚硝酸盐和硝酸盐的实测信号与空白溶液信号。根据标准品溶液十次重复进样的数据来确定和评估该方法在LOD和LOQ水平的性能。

图2所示为分析亚硝酸盐和硝酸盐LOD和LOQ溶液得到的代表性色谱图。LOD和LOQ水平的方法性能如图3所示。亚硝酸盐的LOD和LOQ分别为0.01和0.025 µg/mL。硝酸盐的LOD和LOQ分别为0.05和0.075 µg/mL。LOQ水平十次重复进样的数据证明该方法具有出色的重复性，亚硝酸盐和硝酸盐的峰面积RSD分别为4.30%和5.52%（图3）。

线性和浓度范围

分别在0.025~5 µg/mL和0.05~5 µg/mL范围内绘制亚硝酸盐和硝酸盐的标准曲线。以峰面积为y轴，浓度为x轴所做的标准曲线呈线性，相关系数(R²) ≥ 0.999（图4）。 

聚乙烯吡咯烷酮分析

聚乙烯吡咯烷酮又称聚维酮或PVP，是制药行业使用的一种合成聚合物，常用作片剂和胶囊制造工艺中的粘合剂、滴眼液的成膜剂、用于液态制剂和咀嚼片的调味，以及用作透皮系统的胶粘剂⁷。

我们使用此次开发的方法分析了浓度为1 mg/mL的PVP水溶液测试样品。PVP样品以及加标亚硝酸盐和硝酸盐的PVP样品的代表性色谱图如图5所示。该方法有效分离了高浓度PVP峰与亚硝酸盐和硝酸盐峰。PVP测试样品中未检出亚硝酸盐，但检出了0.04 µg/mL的硝酸盐残留。

方法准确度

通过测定以0.05、0.1和0.5 µg/mL三个浓度加标的PVP样品中亚硝酸盐和硝酸盐的回收率来评估该方法的准确度。计算硝酸盐回收率时，根据样品中已有的含量校正了结果。亚硝酸盐和硝酸盐的回收率（每个浓度水平n=6）分别在93%~100%和91%~100%范围内（图6），符合不超出90%~110%的可接受标准。

本研究使用Arc Premier系统和Atlantis Premier BEH C₁₈ AX色谱柱，开发了一种采用直接进样法一并分析亚硝酸盐和硝酸盐的LC/UV方法。该方法在亚硝酸盐(0.025 µg/mL)和硝酸盐(0.075 µg/mL)的LOQ水平表现出优异的性能。实验证明该方法适用于分析聚乙烯吡咯烷酮辅料，亚硝酸盐和硝酸盐的回收率介于91%~100%之间。这种LC-UV方法为筛查PVP K15辅料或原料中的亚硝酸盐和硝酸盐提供了快速简单的解决方案。

1. https://wwwn.cdc.gov/TSP/ToxFAQs/ToxFAQsDetails.aspx?faqid=1186&toxid=258.
2. European Medicine Agency, Procedure under Article 5(3) of Regulation EC (No) 726/2004.Nitrosamines impurities in human medicinal products EMA/369136/2020.
3. FDA Guidance document, Control of nitrosamine impurities in human drugs, guidance for industry.
4. Boetzel R, Schlingemann J, Hickert S, Korn C, Kocks G, Luck B, Blom G, Harrison M, Francois M, Allain L, Wu Yongmei, Bousraf Y. A nitrite excipient database: A useful tool to support N-nitrosamine risk assessments for drug products.Journal of Pharmaceutical Sciences, (2022) 1–10.
5. Holzgrabe U. Nitrosated Active Pharmaceutical Ingredients – Lessons Learned.Journal of Pharmaceutical Sciences, 000 (2023) 1–6.
6. Jires J, Dousa M. Nitrites as precursors of N-nitrosation in pharmaceutical samples – A trace level analysis.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 213 (2022) 114677.
7. https://www.drugs.com/inactive/polyvinylpyrrolidone-271.html.