• 应用纪要

利用Oasis™ MCX SPE进行简单、快速、高选择性的治疗药物来那度胺生物分析样品的血浆萃取

利用Oasis™ MCX SPE进行简单、快速、高选择性的治疗药物来那度胺生物分析样品的血浆萃取
  • Faizali Rahim
  • Kim Van Tran
  • Mary Trudeau
  • Waters Corporation
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摘要

本研究展示了一种简单、通用、广泛适用的全自动生物分析样品前处理策略，无需开发方法，适用于小分子治疗药物来那度胺的多种常见生物分析萃取技术，包括蛋白沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。Andrew+™移液机器人与Extraction+互联装置的结合实现了完全自动化的液体处理和固相萃取(SPE)样品前处理，凸显了混合模式SPE（使用Oasis WCX从血浆中萃取）的LC-MS生物分析定量性能。

优势

  • 简化的生物分析样品前处理策略，无需开发方法即可从生物基质中成功萃取分析物
  • 通用的萃取方法方案，从萃取的血浆中获得的分析物回收率高，结果可重现，无需优化
  • 使用96孔µElution萃取板实现快速的生物分析萃取(<30 min)
  • 自动化样品萃取，可执行“无人值守”方法，减少人为错误的风险，提高分析性能并节省科学家的时间
  • 使用ACQUITY™ Premier HSS T3色谱柱可在3 min内完成快速UPLC ™分析
  • 在0.5~100 ng/mL的浓度范围内具有出色的定量性能，QC准确度在96%~112%范围内，RSD ≤5%

简介

来那度胺(Revlimid®)是一种小分子治疗药物，用于多发性骨髓瘤的治疗，也作为肥胖症干细胞移植的维持药物1,2。 随着对该药物和新一代疗法的持续研究和开发，对稳定、灵敏且具有选择性的生物分析样品前处理和液相色谱-质谱(LC-MS)分析的需求也在持续增加。生物分析方法开发的重点在于三个主要方面：1-检测、2-分离、3-从各种生物基质组分中萃取分析物，确保高灵敏度、高选择性、可重现地定量目标分析物。

本研究评价了几种常用的生物分析技术，包括蛋白沉淀法(PPT)、去除磷脂(PL)的PPT、液液萃取(LLE)、反相(RP) SPE、去除PL的RP-SPE，和混合模式SPE，用于从血浆中萃取治疗性药物来那度胺。所有萃取技术均使用制造商推荐的通用方案进行评估，包括回收率和样品洁净度。最终的样品前处理和萃取在Andrew+移液机器人上自动化执行，以简化工作流程并提高流程效率，尽可能提高生产率，并确保整体分析的方法性能。

实验

材料

来那度胺购自Sigma-Aldrich D5，用作内标(IS)的d5-来那度胺购自Cayman Chemicals (www.caymanchem.com)。LC-MS级甲酸、磷酸、氨水、乙酸乙酯购自Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)。甲醇和乙腈购自Honeywell (lab.honeywell.com)。 

LC/MS分析

LC-MS/MS分析使用Xevo™ TQ-XS串联四极杆质谱仪(ESI-)，并使用ACQUITY I-Class PLUS UPLC系统和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（P/N：186003538）进行色谱分离。使用0.1%甲酸(MP A)和0.1%甲酸的乙腈溶液(MP B)，流速为0.7 mL/min。起始LC条件保持0.5分钟，然后在1分钟时增加至30% MP。然后将MP B增加至90%以冲洗色谱柱，并在2分钟时恢复到起始梯度条件。总分析时间为三分钟。萃取样品的进样体积为5 μL。

样品前处理

使用甲醇(MeOH)配制来那度胺和d5-来那度胺的储备液(1 mg/mL)。工作储备液（10 µg/mL，用于制备血浆中的标准曲线样品和QC样品）也使用甲醇制备。向市售Sprague-Dawley大鼠血浆中加入来那度胺。标准曲线样品的制备浓度范围为0.250~500 ng/mL，质量控制(QC)样品的制备浓度为0.75、7.5和75 ng/mL。制备标准曲线和QC血浆样品，每个浓度制备三次。

样品萃取

表1中列出了每种生物分析萃取技术的萃取方案，图示请参见图1。在所有情况下，都根据制造商的指南来制定方案。

图1.用于评估的各种萃取方法的所有样品前处理萃取方案图示。所有方法均基于各制造商维护和使用手册中提供的体积和溶剂指南。 
表1.样品萃取方法、维护和使用说明参考资料，以及来那度胺萃取方法评估的起始方案表。

回收率和基质效应计算

分析物回收率按照以下公式计算：

其中，峰面积A = 萃取样品的峰面积，峰面积B = 萃取后向萃取基质样品加入化合物后的峰面积。

基质效应按照以下公式计算：

存在基质时的峰面积是指在萃取之后向萃取的空白基质样品中添加化合物后的峰面积。无基质时的峰面积指在纯溶剂溶液中分析物的峰面积。

磷脂监测

残留磷脂(PPL)（用作评估样品洁净度的指标）采用与来那度胺相同的UPLC梯度进行分析。质谱系统在ESI+模式下运行，使用184.1母离子扫描，扫描质量范围400~1000 m/z，扫描时间1 s。锥孔电压设置为30 V，碰撞能量为30 eV。

自动化平台

Andrew+移液机器人，搭配Extraction+互联装置，由基于云的OneLab™软件控制，用于设计并执行最终样品前处理和生物分析萃取方案，对血浆中的来那度胺进行定量评估。

结果与讨论

使用ACQUITY UPLC I-Class与在ESI+模式下运行的Xevo TQ-XS质谱仪系统联用，对来那度胺进行了LC-MS/MS定量分析。使用MS/MS多重反应监测(MRM)通道进行检测和定量，来那度胺和d5-来那度胺ISTD的分析为260.2>148.85 (CE 25 eV)和265.0>149.9 (CE 20 eV)。来那度胺具有很强的极性，cLogP为-0.685。因此本分析采用ACQUITY UPLC HSS T3 100 Å, 1.8 µm, 2.1 mm × 50 mm色谱柱，以确保获得理想的色谱保留性能。来那度胺和用作ISTD的d5-来那度胺的色谱性能如图2所示。采用LC梯度分离，流动相分别为水(MP A)和乙腈(MP B)，二者均含有0.1%甲酸。MP A保持100% 0.5分钟，然后在0.5分钟内以缓梯度降低至70%，然后使用高浓度有机相溶剂冲洗色谱柱。柱温为45 ˚C，流速为0.7 mL/min。总分析时间为三分钟。

图2.使用ACQUITY UPLC HSS T3 100 Å, 1.8 µm, 2.1 mm × 50 mm色谱柱对来那度胺和来那度胺d5 ISTD (1 ng/mL)进行LC色谱分离。

回收率和基质效应

萃取效率和洁净度评价是所有生物分析程序中的关键步骤。这是通过计算目标分析物在不同萃取技术中的回收率和基质效应来完成的。计算公式详见“材料与方法”一节。图3展示了供应商推荐的各种通用样品萃取程序的回收率和基质效应(ME)结果。样品前处理技术按选择性从低到高排列，从更通用的方法（例如蛋白沉淀）开始，到选择性和特异性更高的混合模式SPE程序。总体趋势为，回收率随着SPE方法特异性的提高而提高，基质效应则相应降低。Sirocco PPT、去除PL的Ostro PPT和Oasis MCX的回收率最高(>80%)，而采用SSLE和反相HLB SPE方法制备的样品在所有技术中回收率最低。需要注意的是，该技术或任何技术都只进行了少量优化，因为我们的目标之一是对遵循所有产品推荐的供应商方案。使用反相SPE时，来那度胺的极端极性（cLogP为-0.685）导致在上样步骤中保留性损失，因此导致的低回收率在意料之中。而使用MCX混合模式吸附剂则表现出优异的回收率(88%)。在本例中，来那度胺的碱性pKa为10.75，将其与带负电荷的MCX吸附剂相结合，最终在SPE上样实现了保留。与标准Sirocco PPT (-26.7%)相比，去除PL的Ostro PPT(-8.4%)的基质效应大幅降低，而使用Oasis MCX SPE的基质效应为9.3%，表明了萃取的选择性。

图3.使用图1/表1中列出的技术从血浆中萃取来那度胺获得的代表性回收率和基质效应结果。使用去除磷脂的Ostro PPT（回收率为82.8%，基质效应为-8.4%）和Oasis MCX SPE（回收率为88.2，基质效应为9.3%）获得了回收率与基质效应的理想平衡。

残留磷脂

通常，评估样品洁净度的另一项常用指标是观察萃取样品中的残留磷脂(PL)。血浆的主要成分是磷脂，主要的亚成分是磷脂酰胆碱。我们可以利用MS检测来监测184 m/z处的母离子，它对应于磷脂酰胆碱的极性头部基团。监测该通道可以检测萃取样品中残留的各种磷脂酰胆碱。该程序的详细介绍请参见“材料与方法”部分。图4中展示了对不同萃取方案中的样品浓度和/或稀释进行校正，并根据标准有机PPT萃取结果进行归一化后，残留PL的MS强度。不出所料，简单PPT残留的PL最多。与使用Sirocco PPT板的标准PPT相比，使用去除PL的Ostro PPT和Oasis MCX SPE显著降低了萃取样品中的PL含量，去除率超过98%以上。

图4.样品萃取技术的洁净度图示，突出展示了去除PL的Ostro PPT和Oasis PRiME HLB以及Oasis混合模式MCX萃取（已归一化至Sirocco蛋白沉淀法）在磷脂去除方面的理想效果。在本次评估中，使用每种样品前处理技术检测到的残留磷脂的MS强度（MS母离子184扫描）根据起始样品体积，并根据所得样品洗出液中的任何差异进行了校正。

生物分析定量

我们最终选择了Oasis MCX SPE 96孔板来萃取血浆中的来那度胺，因为它能在回收率、基质效应和残留磷脂之间实现理想平衡。表2列出了使用配备Extraction+互联装置的Andrew+移液机器人充分制备并萃取血浆中的标准品(A)和QC样品(B)得到的定量结果汇总。线性动态范围确定为0.5~100 ng/mL（线性拟合>0.996），标准曲线准确度范围为92.7%~115.9%，RSD范围为1.38%~16.6%。分析QC样品的表现相似，在各QC浓度下的准确度范围为96.5%~111.8%，RSD范围为2.84%~4.81%。这一定量性能能够轻松满足推荐的生物分析方法验证指南标准3。QC样品与空白样相比的代表性色谱图如图4所示。

表2.使用Andrew+移液机器人和Oasis MCX 96孔板制备和萃取来那度胺获得的血浆定量性能。来那度胺的标准曲线(A)和QC (B)统计数据，准确度偏差和RSD均≤15%。
图5.使用Oasis MCX SPE从血浆中萃取的来那度胺QC样品的代表性色谱图。

结论

本应用重点介绍了来那度胺从血浆中的成功SPE萃取和LC-MS/MS定量分析，且无需进行方法开发。使用Oasis MCX进行SPE萃取获得了较高的分析物回收率(88%)、较低的基质效应(<10%)，并且萃取样品中的残留磷脂也非常低。通用方案与Andrew+移液机器人（配备Extraction+互联装置）的自动化样品前处理方案相结合，可极大地简化样品萃取流程并提高流程效率，大幅提高实验室生产力，减少错误，并确保分析方法的整体性能。

参考资料

  1. https://go.drugbank.com/drugs/DB00480.
  2. https://www.chemexper.com/cheminfo/servlet/org.dbcreator.MainServlet?from=1&format=google2008&action=PowerSearch&sort=%3E%7Etopranking.value&realQuery=rn.value%3D191732-72-6&target=entry.
  3. Bansal, S.; DeStefano, A. Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small Molecules.The AAPS Journal 2007, 9 (1), E109–E114.

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