Andrew+™机器人和OneLab™自动移液工作站在Fungitell®葡聚糖测定中的应用

证明Andrew+和OneLab经配置可用于执行Fungitell®葡聚糖测定方法。

Fungitell测定法是一种使用96孔微孔板的鲎试剂(LAL)比色法，可用于测定(1→3)-β-D-葡聚糖(BDG)，这种物质是多种具有重要医学意义的真菌的主要细胞壁成分¹。 Fungitell已获FDA认可和CE认证，对于有侵袭性真菌感染症状的患者或表现出侵袭性真菌感染易感病情的患者，Fungitell可用于检测他们血清中的BDG^2,3。 这种基于LAL的测定方法是一种相当灵敏的酶促级联方法，能够检测出皮克/毫升（pg/mL，10^-12 g/mL）浓度水平的葡聚糖^3,4。该测定方法相当复杂，需要执行许多移液步骤。它的标准曲线构建、样品制备、样品排列和试剂分装操作全都耗时又繁琐，但都是该测定方法中的关键步骤。如果能在构建标准曲线和制备样品的过程中实现自动化的液体处理操作，并利用自动化技术在孔板上排布样品和标准样，将有助于提升这类测定的效率。自动化工作流程能将分析人员从重复且耗时的操作中解放出来，从而提高效率，提升分析工作的质量，还能保证操作一致性。此外，OneLab的事件日志功能还带来了额外的优势，能确保工作流程全程可追溯，简化分析和调查工作。

LAL葡聚糖分析执行说明：如前文所述，这类方法可以检测pg/mL浓度水平的微量葡聚糖。按照使用说明书(IFU)的要求，必须先对执行测定时会用到的所有材料进行潜在干扰测试。出色的实验技术和清洁的实验环境是执行这类测定的必要条件。本文中的结果均使用Andrew+装置在静态外罩中采集而得。

本文展示了使用Andrew+和OneLab配合标准移液枪和Domino模块执行Fungitell测定方法的应用实例及所得结果。Domino是放置试管、孔板、移液枪头、试剂和其他材料的模块化承载装置，可在实验台面上以各种组合配置。图1展示了移液机器人和实验台面上相关Domino的仪器配置。

这项针对Andrew+系统的初步评估创建了一套OneLab方案，使用目前可用的Domino来执行Fungitell。方案设计旨在评估Andrew+和OneLab创建标准曲线及制备样品的能力。这项评估考察了使用Andrew+移液的实验结果，据此评判它测定标准曲线连续稀释样以及为多次运行制备样品的一致性。

Fungitell方法的关键因素之一是标准曲线的构建。本文所述的每一块孔板上都制备了一组新的稀释样，用于生成新的标准曲线。以500 pg/mL的样品为起始样，通过300 µL:300 μL的连续稀释操作制得稀释样，创建500、250、125、62.5和31.25 pg/mL这5个浓度点的标准曲线。按照实验方案的指导，将标准样一式两份上样至孔板。通过以下方式分析各孔板上每条标准曲线的速率数据(mAbs/min)：对每次运行的数据执行线性回归拟合，得到斜率、截距和R值。为得到这组标准曲线数据，我们分2天运行了8次分析，结果汇总于图2。

这8次运行的斜率和截距变异系数分别为2.3%和11.5%。R值都很出色，最小值为0.997（要求R ≥ 0.980）。以上结果皆在Fungitell测定方法说明书规定的验收标准之内。

除了评估标准曲线，我们还在这些实验中测定了各种样品。在孔板上制备样品是Fungitell方法中非常重要且可能导致出错的一步。制备样品的具体操作是向孔板上的每个孔中加入5 µL样品和20 µL碱性预处理溶液。加入5 µL粘稠的血清样品这项操作有时会产生显著的差异，因为每次加入都是一个单独的移液步骤。在一组实验中（图3），我们用糖溶液连续稀释3个样品，以此模拟血清的粘度。通过手动稀释制备这3个样品，然后采用典型的Fungitell工作流程来测定它们。

这3个样品被设计为分别在大约180、90和45 pg/mL的样品浓度下得出结果。目的是考察不同孔板上和不同浓度下样品结果的差异。每个样品在每块孔板上运行6次，然后分析18个结果。样品的变异系数从6%到11%不等。结果表明，各样品的一致性良好。
在另一组实验中，我们测定了2个血清样品。这些样品通过向市售的不含抗凝剂的(off-the-clot)普通血清中添加葡聚糖制备而成。目标浓度分别为250~300 pg/mL和125~150 pg/mL。这2个样品都在3块孔板上进行了测定，每个样品10个重复样。如前文所述，每个血清样品都通过一个单独的5 μL移液步骤上样。我们研究了3块孔板的数据，结果汇总于图4。

同样，这些结果的质量良好，3块孔板的样品结果差异在大约4%~7%范围内。有必要指出的是，有一个结果被剔除出了样品B的分析，因为该结果> 415 pg/mL。我们实际检查了孔板、了解了这个样品的实验设计（即：使用单个移液枪头转移样品；单孔；相同的散装样品），还检查了OneLab的实验执行日志，据此确认样品上样模式没有异常；调查结论是该孔为一个“高温”孔。这个数值对于整个孔板和整组数据而言也是一个统计上的异常值。

分2天采集8块孔板的数据，所得标准曲线斜率（CV 2.1%，n=8）和截距（CV 11.5%，n=8）的变异系数都很小，且每次运行的线性拟合R值都达到了0.997或更大值。对比在类似实验条件下使用同批次试剂和材料手动执行本测定方法所得的标准曲线结果的变异系数范围，以上结果与之相当甚至更优。

这些实验测定了2组含葡聚糖的样品。每组样品都在同一天完成测定，使用同批次的试剂和材料，在3块孔板上进行重复测定。在这2组样品中观察到良好的变异系数，大约在4%~11%之间。综上，这些结果表明，OneLab设计的实验方案搭配Andrew+移液机器人成功执行Fungitell测定方法，所得结果符合使用说明书中给出的预期要求。

目前已经有一些文献提出用定制化的自动工作流程来执行基于LAL的内毒素⁵和葡聚糖测定方法⁶。但这些方案全都需要克服操作一致性不佳和易受污染的问题，没有任何一套方案具备Andrew+简单易实施的优点。

1. Odabasi, Z., Paetznick, V., Rodriguez, J., Chen, E., McGinnis, M., and Ostrosky-Zeichner, L. 2006.Differences in beta-glucan levels of culture supernatants of a variety of fungi.Medical Mycology 44: 267–272.
2. De Pauw, B., Walsh, T.J., Donnelly, J.P. et al.2008. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer /Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institutes of Allergy and Infectious disease Mycosis Study Group (EORTC/MSG) Concensus Group.Clin.Inf.Dis. 46: 1813–1821.
3. Tanaka, S., Aketagawa, J., Takahashi, S., Tsumuraya, Y., and Hashimoto, Y. 1991. Activation of a Limulus coagulation factor G by (1→3)-ß-D-Glucans.Carbohydrate Res. 218:167–174.
4. Fungitell Instructions For Use.https://www.fungitell.com/fungitell_assay#Kit_ifu.
5. Tsuji KI, Martin PA, Bussey DM.1984 Automation of chromogenic substrate Limulus amebocyte lysate assay method for endotoxin by robotic system.Applied and environmental microbiology.Sep 1;48(3):550-5.
6. Prüller, F., Wagner, J., Raggam, R.B., Hoenigl, M., Kessler, H.H., Truschnig-Wilders, M. and Krause, R., 2014.Automation of serum (1→3)-beta-D-glucan testing allows reliable and rapid discrimination of patients with and without candidemia.Medical mycology, 52(5): 455–461.