• 应用纪要

使用Andrew+™移液机器人和OneLab™软件进行细菌内毒素检测

使用Andrew+™移液机器人和OneLab™软件进行细菌内毒素检测
  • Robert D’Ordine
  • Associates of Cape Cod Inc.
  • Waters Corporation
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摘要

证明Andrew+和OneLab经配置可用于执行Pyrochrome®动态显色法。

简介

为确保安全，任何注射药物或医疗器械都必须接受热原检测1。例如，所有疫苗和生物制剂都必须通过测试来确定最终配方中是否含内毒素。热原检测可通过内毒素测定试验来实施，例如Pyrochrome2。它是一种基于鲎试剂(LAL)的酶促级联检测方法3,4，灵敏度非常高，可检出亚纳克水平(10-9 g/mL)的内毒素。这种使用96孔微孔板的LAL显色测定方法操作流程非常复杂，需要执行大量移液步骤。它的标准曲线构建、供试品阳性对照(PPC)制备、样品排列和试剂分装操作全都耗时又繁琐，但都是成功实施该方法的关键步骤。如果能自动化完成标准曲线、PPC和样品制备过程中的液体处理步骤以及孔板上的待测样上样步骤，将显著提高这类测定的效率。自动化工作流程能将分析人员从重复且耗时的操作中解放出来，从而提高效率，提升分析工作的质量，还能保证操作一致性。此外，OneLab的事件日志功能还带来了额外的优势，能确保工作流程全程可追溯，简化分析和调查工作。

LAL内毒素分析执行说明：如前文所述，这些检测方法可以检测低至0.005 EU/mL（EU：内毒素单位）水平（即亚纳克(10-9 g/mL）的微量内毒素。按照使用说明书(IFU)的要求，必须先对执行测定时会用到的所有材料进行潜在干扰测试。出色的实验技术和清洁的实验环境是执行这类测定的必要条件。为满足以上要求，本文中的结果均使用Andrew+装置在静态外罩中采集而得。 

本文展示了使用Andrew+和OneLab配合标准移液枪和Domino模块执行Pyrochrome基础方案的应用实例及所得结果。Domino是放置试管、孔板、移液枪头、试剂和其他材料的模块化承载装置，可在实验台面上以各种组合配置。图1展示了移液机器人和实验台面上相关Domino的仪器配置。

图1.用于细菌内毒素检测的Andrew+机器人配置。
这是得出本应用纪要中所述的Pyrochrome检测结果所采用的实验配置。实验中使用了以下规格的蓝牙连接电子移液枪：300 µL多道移液枪和300 µL单道移液枪。LRW是LAL的试剂用水。

结果与讨论

这项针对Andrew+系统的初步评估创建了一套OneLab方案，使用目前可用的Domino来执行Pyrochrome方案。方案设计旨在评估Andrew+和OneLab能否高度一致地构建标准曲线和制备样品和PPC，并且分4天运行多次。Pyrochrome方法的关键因素之一是标准曲线的构建。每块孔板上都生成了新的标准曲线。以500 EU/mL的储备液为起始样，通过30 µL:270 µL的连续稀释操作制得稀释样，创建50、5、0.5、0.05和0.005 EU/mL这5个浓度点的标准曲线。各标准样一式三份上样至每块孔板。通过以下方式分析每块孔板的标准曲线反应时间（每个样品达到0.03 OD阈值的时间）数据：绘制14次运行中每次运行的双对数坐标图，并对转换后的数据进行线性回归拟合，得到斜率、截距和R值。结果汇总于图2。这14次运行的斜率和截距变异系数分别为4.1%和1.2%。R值都很出色，最小值为0.995（要求R ≥ 0.980）。以上结果皆在说明书中规定的Pyrochrome方法执行标准之内。

图2.用Andrew+执行Pyrochrome方法生成的标准曲线。
这组数据（14次运行）是使用同批次的试剂和内毒素参比标准品，分4天运行分析得到的。每块孔板的标准曲线都采用单独的一组稀释样创建。所示线性拟合是每块孔板数据的双对数坐标图。绘制这些标准曲线所用的标准样浓度为50、5、0.5、0.05和0.005 EU/mL。相关的图中绘制出了14条标准曲线中每一条曲线的所有反应时间数据（x轴上的每个数值总共有42个点）。相关的表格列出了14条标准曲线的斜率和截距平均值。

除了标准曲线评估，我们还在这些实验中测定了1个样品和2个PPC。以水为溶剂手动制得浓度约为0.5 EU/mL的样品，上样至工作台。使用Andrew+将样品与5 EU/mL标准品混合（与构建标准曲线时一样，按30 µL:270 µL的比例稀释10倍），制得2份PPC。预计的浓度约为1.0 EU/mL。将样品和PPC分别上样至每块孔板上的10个孔中。我们研究了14块孔板的数据，结果汇总于图3。本实验计算了每块孔板上每个样品和PPC的平均值。样品(24.6%)和PPC(16.3%)的变异系数计算值较大，部分原因是数据由双对数坐标图反算而得。此外，有必要指出的是，样品为每天手动制得。经计算，所有孔板上的样品的实际平均值为0.57 EU/mL。该值相较于14块孔板的预期值的偏差在14%以内。PPC平均值1.04 EU/mL相较于14块孔板的预期值的偏差在4%以内。所有孔板上PPC的平均回收率为93.5%，完全在规定的范围(50%~200%)之内。
请注意，本文中的实验采集所有数据时都使用同批次的试剂和材料。内毒素样品均来自同批次的内毒素参比标准品。

图3.样品和供试品阳性对照(PPC)的Pyrochrome结果汇总。
这组样品和PPC数据是使用同批次的试剂和内毒素参比标准品，分4天运行14次分析得到的。各孔板上的每次样品运行或PPC运行都采集10个结果；用一份样品和一份标准品稀释液制备一组（2份）单独的PPC稀释液上样至每块孔板作为待测样。所示结果是根据前文图2中各条线性拟合得出的反算值。散点图中的直线代表每组数据的平均值。

结论

如前文所述，14块孔板得出的斜率和截距结果都呈现出较低的变异系数，且每块孔板线性拟合的R值都等于或优于0.995。此结果与我们在手动执行该方法所得的历史数据中观察到的变异系数范围一致。

14块孔板样品分析结果的变异系数约为24.6%，总体平均结果相较于预期值的偏差在14%以内。所有PPC结果都在指定范围(50%~200%)之内，符合方法要求，且所有孔板的平均值相较于预期值的偏差在4%以内。综上，这些结果表明，Andrew+可以成功执行Pyrochrome测定方法，所得结果符合使用说明书中给出的预期要求
目前已经有一些文献提出用定制化的自动工作流程来执行类似的LAL内毒素分析方法5,6。 但这些方案全都需要克服操作一致性不佳和易受污染的问题，没有任何一套方案具备Andrew+简单易实施的优点。 

参考资料

  1. Bacterial Endotoxins Test, United States Pharmacopoeia <85>.
  2.  Pyrochrome Instructions for use https://www.acciusa.com/tools-and-resources/package-insert-sheets/.
  3. Lindsay, G. K., P. F. Roslansky, and T. Novitsky.1989. Single-Step, Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay for Endotoxin J. Clinic.Microbiol.27:947–951.
  4. Prior, R.B., 1990.The Limulus amoebocyte lysate test.In Clinical Applications of the Limulus Amoebocyte Lysate Test (p. 27).CRC Press Boca Raton, FL.
  5. Tsuji KI, Martin PA, Bussey DM.1984 Automation of chromogenic substrate Limulus amebocyte lysate assay method for endotoxin by robotic system.Applied and environmental microbiology.Sep 1;48(3):550-5.
  6. Jorgensen, J.H. and Alexander, G.A., 1981.Automation of the Limulus amoebocyte lysate test by using the Abbott MS-2 microbiology system.Applied and environmental microbiology, 41(6):1316–1320.

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