利用ACQUITY™ QDa™ II质谱检测器方法开发推进牛奶和婴儿配方奶粉中游离脂肪酸的分析

牛奶和婴儿配方奶粉样品中的游离脂肪酸(FFA)分析可用于质量控制、产品开发和合规性分析。在食品行业中，缺少简单明了的FFA分析方法。本研究将深入介绍使用LC-MS分析FFA的方法开发过程。我们研究了一系列LC色谱柱、流动相、LC梯度和流速，然后使用选定的市售样品来分析最终方法的灵敏度、重复性并进行了初步验证。所开发的方法不仅为牛奶和婴儿配方奶粉样品提供了可靠的FFA筛查解决方案，还为进一步优化后对各种样品类型进行常规FFA定量分析开辟了道路。

优势

• 实时、定性和定量LC-MS方法开发
• 可在不到6 min内快速实现19种FFA (C8:0~C24:0)的色谱分离
• 利用质量数信息区分保留时间相似但质量数不同的化学组分
• 高灵敏度和高重复性的方法
• 从真实样品中轻松快速地提取FFA

脂肪酸(FFA)在塑造乳制品独特的感官和视觉特征方面发挥着关键作用。然而，由于高浓度FFA会产生不良风味，进而导致酸败，因此需要谨慎管理脂肪酸对风味的显著影响¹。 此外，这些脂肪酸的氧化又带来了另一项挑战，表现为乳制品的适口性下降和品质变差。由于脂质分解为醛、酮和醇，这种降解过程会产生一种令人不悦的“酸败”风味²。特别是在婴儿配方奶粉配方中，保持理想风味变得至关重要，因为这些配方是婴儿膳食摄入的基本组成部分。

对婴儿配方奶粉和牛奶中的FFA进行系统性筛查至关重要，涵盖了质量控制(QC)、产品改进、认证和法规合规性等多种关键功能。这类FFA是婴儿配方奶粉和牛奶中营养和风味成分不可或缺的一部分。除了作为能量来源，FFA还充当脂溶性维生素（如A、D、E和K）的重要载体。此外，FFA还通过建立保护性脂肪层为婴儿提供物理保护，同时促进视觉和神经系统的发育。因此，全球都强制要求对婴儿配方奶粉进行严格审查，监管审查也十分之严格。此外，奇数链饱和脂肪酸（尤其是C15:0和C17:0）的鉴定和定量分析对于作为2型糖尿病、中风和特定原因死亡率等的生物标志物，具有深远的意义。因此，FFA分析的关联性和影响不仅限于在婴儿配方奶粉和牛奶的评估范围^3,4。

脂肪酸具有非极性特点，因此需要极性相对较低的色谱柱才能实现高效的色谱分离。此外，洗脱过程需要使用陡峭的有机相梯度，以确保理想的分离效果。目前，游离脂肪酸的评估主要采用气相色谱(GC)，该方法通常与火焰离子检测器(FID)或高分辨率质谱仪(HRMS)结合使用。但是，GC分析需要将脂肪酸转化为脂肪酸甲酯(FAMES)，这一步骤常常带来挑战，例如增加MS噪音水平、影响响应灵敏度、产生干扰、成本增加和分析复杂性增加等。

相比之下，使用液相色谱-质谱联用(LC-MS)作为替代方案，具有许多显著的优势。与GC不同，LC-MS不仅操作更简便，还无需对脂肪酸进行衍生化出力，因此消除了分析人员出错等相关复杂问题，同时保持样品的完整性。

前述的主流FFA分析技术通常具有操作复杂、成本高昂且依赖与复杂质谱方法设置的特点。相比之下，本研究中介绍的是一种精简常规的FFA分析方法，该方法在配备ACQUITY QDa II质谱检测器的LC上使用标准化的FFA混合物进行分析，每个样品在六分钟内即可获得结果。

数据管理

使用MassLynx™ v4.2采集数据完成，使用TargetLynx™处理数据。

样品

用于分析的GLC参比标准品426（包含20种游离脂肪酸，范围从C6:0到C24:0）购自Nu-Chek Prep（美国明尼苏达州）。标准品中各组分的重量百分比范围为2%~16%（表3）。混标中各FFA组分的浓度与真实样品中的浓度相近。

将市售牛奶和婴儿配方奶粉样品用甲醇(MeOH) (1:5)稀释，然后在10,000 g下离心5 min。得到的上清液用去离子水(1:5)进一步稀释。然后用流动相A和B (1:1)稀释溶液，并转移到LC样品瓶中进行LC-MS分析。

色谱分离

LC-MS方法开发的第一步是筛选合适的LC色谱柱和流动相。由于烃链的长度和羧酸等官能团的存在，FFA的极性可能有所不同。碳原子数较少的短链FFA的极性通常较低，而碳原子数较多的长链FFA由于羧酸基团的存在，极性往往更高。

本应用中测试了三种ACQUITY UPLC色谱柱，分别为AX BEH C₁₈、CSH C₁₈和BEH苯基柱。AX和CSH色谱柱在目标FFA的峰分离上表现不足，并且需要较高的有机相梯度(> 80%)，这会降低峰响应，因为MS离子源需要水来实现理想的电离效率。使用苯基柱时，在6 min的梯度内，20种混合物组分（范围从C8:0到C24:0）中有19种组分实现了理想的峰分离。

无论流动相B的组成如何，均可得出结论：流动相A中的1 mM甲酸铵水溶液(NH₄HCO₄)对于电离样品中的FFA至关重要。浓度高于1 mM的NH₄HCO₄会显著降低信号强度（图1）。

在确定上述最终方法之前，测试了三种方法（表5）。所有方法均使用相同的流动相A。流动相B影响峰分离和MS响应。使用异丙醇(IPA)和乙腈(ACN) (1:1)作为流动相B改善峰形和响应；但是，始终观察到高背景噪音（图2）。

使用甲醇作为流动相B提供了与ACN相似的响应和灵敏度，但需要非常高的有机相梯度(70%~90%)，这会导致电离效果较差并出现展宽的拖尾峰。

最终的方法条件是以ACN作为流动相B，因为这样对于混标中的大多数FFA而言，该方法的峰分离效果良好、灵敏度较高，且所有组分的重复性RSD均低于8%（表6）。灵敏度定义为定量下限(LLOQ) < 10 pg/ μL (ppb)，对应于婴儿配方奶粉或牛奶样品中的0.01 mg/L（表7）。

由于混标中FFA组分的种类繁多以及FFA的化学性质，必须在梯度开始时将样品稀释剂与FFA组分相匹配。观察到以ACN为流动相B时，使用流动相A:B (1:1)代替甲醇:水(1:1)作为样品稀释剂时，后洗脱组分的响应提高了10倍（图3）。

本研究测试了一系列流速和流动相梯度，以在不降低峰响应的前提下提高峰分离度。对0.8~0.3 mL/min范围内的流速进行评估后，确定了0.4 mL/min是能够提供理想QDa II性能的速率（图4）。

为了从LC色谱柱上洗脱FFA，需要高有机相条件。因此，为了获得早洗脱组分（即C8:0至C12:0）的峰，研究中选择了高有机相起始条件（流动相B为55%）。

将流动相B%从55%提高至90%后，观察到所有化合物在不到1 min的时间内就从色谱柱中快速洗脱。相比之下，将梯度从55%逐渐过渡到80%则取得了良好的结果，峰分离良好（图5）。这种优化的峰分离有助于对混合物中的各FFA应用单离子扫描(SIR)采集模式。实施方法是将采集方法分为5个独立的SIR时间窗口，每个窗口涵盖3~5种不同的FFA组分。

选择SIR采集延长了每种组分的持续时间，从而改善了峰响应和分离，减少了信噪比(S/N)，从而提高了灵敏度和响应重现性，如图6所示。

图6展示了为FFA分析选择的最终LC-MS方法获得的色谱图。在评估一系列方法开发因素后，确定以1 mM NH₄HCO₄水溶液和ACN分别作为流动相A和B，并在BEH苯基柱上以B%从55%~80%为梯度（表1和表2）。

灵敏度和重复性评估

此外，该方法对所有浓度低于10 pg/ μL的FFA组分均表现出高灵敏度，并在高浓度和低浓度条件下均具有良好的重现性，所有组分的%RSD均在0.3%~8.2%之间。

定量下限(LLOQ)确定为20:1 S/N（通过均方根(RMS)计算），以及峰面积达到空白响应的五倍。

使用基质样品进行初步方法验证

为评估此方法的适用性，我们评估了选定的基质样品（图7）。牛奶和婴儿配方奶粉样品中的FFA采用简单的甲醇萃取法进行萃取，并在LC-MS分析前用流动相A和B进一步稀释(1:1)。尽管在牛奶和婴儿配方奶粉中，FFA在脂肪中所占的比例不到2%，但在分析样品中检出的FFA浓度与制造商和文献报道的水平一致^5,6。

该方法展示了在FFA快速、高样品通量分析（每天最多可分析240个样品）中的适用性，但尚未展示该方法用于定量分析研究的可靠线性关系（即R² ≥ 0.99）。

综上，将ACQUITY I-Class UPLC与ACQUITY QDa II质谱检测器联用，并结合ACQUITY UPLC BEH苯基柱的创新分析方法，在游离脂肪酸分析方面展现出了明显优势。

该方法不仅可以确保在六分钟内快速准确地分离从C8:0到C24:0的各种FFA，还可以为实验室带来潜在的实质性益处，例如显著节省成本，同时大幅简化了复杂的操作步骤。

此外，该方法还可以节省大量时间（典型的GC-MS分析中，每个样品通常需要20分钟至1小时），帮助研究人员提高生产力和通量，从而提高实验室的运营效率。

总体而言，这种分析方法集速度、灵敏度和简便性于一身，有望在常规FFA分析中实现重大突破，彰显了其作为实验室执行此类分析的重要工具的价值。

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