在Arc™ HPLC系统上使用Maxpeak™ Premier色谱柱技术开发11种硼酸的分离方法

多年来，高效液相色谱(HPLC)一直是分析实验室中的主要分析技术。这项技术非常实用，可用于分析多种分析物。相比于因高性能而需要更高资金投入的UHPLC仪器，HPLC是成本更低的替代方案。HPLC系统在制药行业中也常用于QA和QC类工作，例如批次产品放行检测和方法开发。

本应用纪要将重点介绍使用HPLC仪器开发11种硼酸化合物的分离方法。合成化学中使用硼酸来促进各种化学反应，它们还可用作标记，用于标记通过紫外或荧光检测法难以检出的化合物（例如糖类化合物）。采用XSelect™ Premier HSS T3色谱柱实施最终方法条件，所有11种化合物均获得完整分离。

优势

• 单次运行即可实现11种结构相似硼酸的基线分离
• 对五种不同的HPLC色谱柱进行色谱柱筛选，以突出选择性差异
• 系统性筛选方案可用于简化方法开发

硼酸是合成化学中常用的一类化合物，它们会参与硼酸与有机卤化物交叉偶联的Suzuki-Miyaura偶联反应。通过此反应可以创建各种不同的生物活性分子，并创建化合物库用于研究结构-活性关系¹。硼酸还可用于标记某些含二醇基的化合物²。它们在这些工作流程中普遍存在，无论是作为标记二醇基化合物的一部分，还是作为偶联反应的反应监测，都需要进行分析。开发出一种能够分离最常见硼酸的方法非常重要，可以用于监测这些硼酸与其他反应前体或最终产物的使用情况。

为了开发出适用方法，我们通过文献检索选择并分析了11种常用的硼酸。图1所示为本应用纪要中检测的11种硼酸的化学结构。分析方法使用之前文献报道的系统性筛选方案开发，并针对配备单柱温箱和PDA检测器的Arc HPLC系统进行了调整^3-5。该方法采用分层筛选模型，通过省去全因子分析简化了方法开发，同时将处理分解为更小、更简便的步骤。由于每个步骤都有明确定义的参数，因此减轻了确定“最佳”条件的压力。该方法开发方案已成功实施多次，并使用MaxPeak Premier色谱柱完成了进一步改进。MaxPeak Premier色谱柱采用MaxPeak高性能表面(HPS)技术，可消除分析物在色谱柱金属表面（例如滤头）上的非特异性吸附。事实证明，这项技术对分析含有磷酸和羧酸基团的酸性化合物以及其他对金属敏感的化合物非常有利^6-8。 由于该技术在其他酸性基团分析中取得了成功，因此本文使用MaxPeak Premier色谱柱来消除这些化合物可能发生的任何非特异性吸附(NSA)。消除NSA后，我们可以确保对色谱分离的任何影响都仅与流动相和固定相有关，而非由表面-分析物相互作用引起。

方法开发工作历时数天，最终确定的方法将在本应用纪要中介绍。

样品描述

每种硼酸的储备液浓度为1 mg/mL。合并储备液，制成每种硼酸浓度为0.09 mg/mL的混合物，执行分析。

如上文系统性筛选方案所述，方法开发的第一步是使用C₁₈固定相在高/低pH条件下对样品（本例中是11种硼酸的混合物）进行测试，由此评估保留性。考虑到化合物的化学结构，在低pH条件下，分析物应呈中性，而在高pH条件下，酸性硼酸基团应至少部分带电荷。硼酸基团中两个氧原子的pKa值约为8和10，在约pH 10的条件下运行意味着其中一个氧原子将完全带电荷。然而，考虑到pH会随有机改性剂变化，因此分离的实际pH可能更接近pH 7，这意味着硼酸基团将带有部分负电荷。引入有机改性剂时pH发生变化的现象是液相色谱分析中一个常见的情况，但实际可能非常复杂，因此经常被忽视^9-10。 图2显示了11种硼酸在XBridge Premier BEH C₁₈色谱柱上的分离结果，分别使用低pH和高pH流动相添加剂（甲酸和氢氧化铵）。

方法开发过程的这一步需要评估保留性。与低pH条件相比，某些硼酸在高pH条件下的保留性较差，尤其是组分3和5，它们被保留在色谱柱的死体积中。组分2在高pH条件下保留性更好，可能是因为该化合物的胺基呈中性。总体而言，化合物在低pH条件下的保留性更好，与高pH条件相比，有更多化合物得到保留。评估保留性是方法开发的这一步骤中唯一需要做的决定，因为后续步骤将用于寻找合适的分离。

系统性筛选方案的第二步是一种更典型的筛选策略，即选择不同的色谱柱固定相，并使用乙腈和甲醇流动相（采用之前选择的流动相添加剂）进行测试。在这一步，选择不同的固定相进行筛选非常重要。选择合适的固定相可确保结果具有广泛的选择性，同时平衡开发速度。通常选择3~4根色谱柱，但测试色谱柱的数量由分析人员决定，有时也可以根据仪器配置来确定。

本研究中除使用XBridge Premier BEH C₁₈色谱柱外，还选择了另外四种色谱柱。首先选择XSelect Premier CSH C₁₈色谱柱，因为它具有相同的键合相，但基质颗粒不同。CSH颗粒在制造时带有少量正电荷，不仅可以改善碱性分析物在低pH条件下的峰形，还可以具有略微的离子交换功能¹¹。

接下来选择的是XBridge Premier BEH苯基色谱柱。该色谱柱使用另一种键合相，专门设计用于与含有苯环的分析物（本应用中选择的所有硼酸）以不同的方式相互作用。然后选择的是XBridge Premier BEH C₈色谱柱，因为这种键合相更短，疏水性弱于典型的C₁₈，有助于缩短分析时间。最后，选择的是XSelect Premier HSS T3色谱柱，这种色谱柱有助于保留先洗脱的化合物。HSS T3固定相使用纯硅胶基质颗粒（与其他固定相使用的两种杂化颗粒不同）和中等覆盖率的C₁₈键合相。T3色谱柱具有较低的键合相覆盖率和高保留性硅胶基质颗粒，非常适合用于保留极性更强的分析物。图3显示了在所示色谱柱上使用甲醇流动相在低pH条件下分离硼酸的结果。

在检查筛选条件并试图找到合适分离方法的过程中，可以发现多个选择性差异。首先，组分9在XBridge (XB) Premier (Prem) BEH C₈色谱柱上的洗脱顺序发生了变化，在组分10之后洗脱。而在所有其他色谱柱上，组分9在组分10之前或与其一起洗脱。组分5和组分6的洗脱顺序也发生了一些变化。在测试的大多数色谱柱上，组分5在组分6之后洗脱。但是，在XB Prem BEH苯基色谱柱上，组分5会在组分6之前洗脱。洗脱顺序的这种变化可能是由于使用甲醇时含苯基的分析物与固定相的苯基键合相之间可能发生的次级相互作用所致。虽然使用甲醇能够使分析物获得良好的选择性和分离度，但这些色谱柱均具有至少一组共洗脱化合物或保留性较差，因此不适合进一步使用。此外，某些色谱柱上还经常出现峰拖尾的峰形问题。图4显示了使用五根相同的色谱柱（但使用乙腈作为强溶剂）对相同分析物进行测试的结果。

与使用甲醇时观察到的结果类似，使用乙腈时，五种色谱柱产生了一些选择性差异。虽然组分9不再与组分10共洗脱或改变洗脱顺序，但组分5和6在色谱柱之间仍表现出一些变化。值得注意的是，使用乙腈时，XSelect (XS) Prem CSH C₁₈色谱柱显示组分6在组分5之前洗脱。与其他被测色谱柱中使用的BEH或HSS颗粒相比，组分6在CSH颗粒上具有不同的相互作用。这种相互作用凸显了为什么在方法开发过程中不仅要筛选不同的键合相，还要筛选不同的基质颗粒，因为选择性受这两者控制。在本例中，使用XSelect Premier HSS T3色谱柱获得了理想分离效果。虽然组分1与组分2未完全分离并且也未完全保留，但HSS T3色谱柱针对这两者的分离效果确实更好，因此是最有可能在优化后提供合适分离效果的色谱柱。

方法优化可能是系统性筛选方案中最耗时的步骤，因为它几乎不受控制。优化过程会受到分析人员的经验以及色谱柱可用性等其他因素的影响。在本例中，优化的目标是在提高分离度的同时增加探头的保留性。理想情况下，希望可以在不牺牲其余分离性能的情况下实现这两个目标。第一个优化步骤是从100%水性流动相开始梯度，这样可以通过降低流动相强度来增加探头的保留性。但是，梯度斜率（6.01%每柱体积）必须保持不变，确保化合物得到正确分离。由于容易发生孔去湿现象，因此并非所有固定相都与100%水性流动相兼容。但是，HSS T3固定相是兼容的，因为其颗粒形态中的键合相密度差异更小¹²。 图5显示了采用原始梯度以及从100%水性流动相开始的修改梯度所得到的硼酸分离结果。

计算峰1的USP分离度和保留因子，确定新梯度条件是否优于原始条件。新方法条件的USP分离度从2.09提高至3.43，保留因子提高约15倍，表明新方法条件的分析性能更出色。虽然组分1和组分2仍然没有得到很好的保留，但它们至少被保留在色谱柱死体积之外。考虑到这些组分的特性，其保留性能符合本应用纪要的要求。根据获得的结果，方法开发过程可以停止，该方法可用于进一步的研究，例如用于追踪含有其中一种硼酸的混合物的反应进程。通过实施系统性筛选方案并采用通用型MaxPeak Premier色谱柱，该方法的开发过程很轻松。将这两者结合使用，分析人员可以获得可靠结果，从而更快、更可靠地开发方法。

硼酸是生成生物活性分子的关键成分。此外，它们还在许多工作流程中用于“标记”分析物，简化检测和分离过程。由于这些组分在关键工作流程和处理中的重要作用，因此需要找到一种合适的分析方法。本文使用系统性筛选方案对11种常用硼酸进行了方法开发，此方案通过提供严格的结构和步骤来指导分析人员，有效简化了新方法的开发过程。将该方法与MaxPeak Premier色谱柱相结合，可消除分析物与色谱柱金属表面之间的次级相互作用，有助于快速开发可靠的方法。本文使用XSelect Premier HSS T3色谱柱和甲酸改性的乙腈流动相开发出一种可分离11种硼酸的方法，使用配备PDA检测器的Arc HPLC系统，此方法可在11 min内分离所有组分。

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