• 应用纪要

评估IonHance六氟异丙醇(HFIP)用于增强型LC-MS寡核苷酸分析的性能

评估IonHance六氟异丙醇(HFIP)用于增强型LC-MS寡核苷酸分析的性能
  • Christian Reidy
  • Makda Araya
  • Catherine Tremblay
  • Balasubrahmanyam Addepalli
  • Matthew A. Lauber
  • Waters Corporation
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摘要

证明使用IonHance六氟异丙醇(HFIP)作为流动相添加剂能够改善寡核苷酸LC-MS分析的电离效果和整体谱图质量。

简介

LC-MS分析对于siRNA、反义寡核苷酸(ASO)、CRISPR单向导RNA (sgRNA)和信使RNA (mRNA)等RNA的精确分离、鉴定和定量至关重要。离子对反相(IP-RP)是寡核苷酸LC-MS分析最常用的方法，通常需要使用由烷基胺和HFIP混合制成的挥发性缓冲液，这种缓冲液在提高分离效率的同时可确保质谱兼容性。即便是使用LC-MS级试剂，分析也会存在挑战，因此务必注意流动相添加剂的品质及其对数据解析的影响。寡核苷酸样品很容易与流动相试剂和添加剂中的痕量金属杂质结合，形成的加合物越多，数据解析就越复杂。IonHance HFIP专为解决这些挑战而开发，其关键在于严格把控生产工艺参数，并致力于实现更高标准的纯度认证。

与传统的酸性缓冲液相比，HFIP可以将MS信号强度增强多达10个数量级1。它是一种具有强挥发性的酸，在电离过程中很容易蒸发。我们投入了大量时间来仔细研究这种日益重要的试剂。

除HFIP的品质外，确保HFIP的供应一致性对于维持可靠的工作流程和可重现的结果也至关重要。关键试剂的供应发生任何中断都可能对样品通量和项目周转时间带来负面影响。IonHance HFIP通过提供最高纯度的试剂以及来自值得信赖的制造商的可靠生产工艺和充足供应，同时解决了性能与供应问题，确保实验室能够持续满足分析需求，避免供应中断的风险。

图1.1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(HFIP)的化学结构和pKa1。

实验

解决方案

IonHance HFIP（P/N：186010781）是一种经过精制、高纯度的六氟异丙醇(HFIP)，能够为LC-MS分析提供优异性能。其采用的专有蒸馏工艺能够满足LC-MS级HFIP试剂对金属含量的严格规格（钠含量<100 ppb，钾含量<100 ppb）。通过确保金属杂质含量尽可能少，从而改善MS信号的清晰度和准确度。

建议在流动相中加入50~100 mM HFIP。在这些试剂浓度下，分析能够在理想的色谱分离度与高MS信号灵敏度之间达到平衡。Ionhance HFIP样品瓶内装有超量灌装的10 mL试剂，适用于常规配制1 L流动相。此浓度范围(0.5%~1% v/v HFIP)可分离长链寡核苷酸（至多100 mer），包括复杂骨架、糖和碱基修饰。应注意尽量减少流动相与氧气的接触，并定期配制新鲜的流动相2。

结果与讨论

高品质HFIP

我们通过ICP-MS分析评估了IonHance HFIP在完成生产和纯化过程后的金属含量。表1列出了两个生产批次的纯化后IonHance HFIP五个重复样的钠(Na)和钾(K)浓度。结果表明，钠和钾的含量水平远低于IonHance HFIP COA报告中规定的<100 ppb规格。

为了进一步说明IonHance HFIP生产工艺对获得高质量MS结果的影响，我们使用ACQUITY™ Premier BEH™ C18 300 Å 1.7 µm寡核苷酸分析专用柱（P/N：186010539）分析了10~60 mer的单链DNA (ssDNA) ladder（P/N：186009449）。配制由N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和1% (v/v) HFIP（纯化前和纯化后）组成的等效流动相，然后比较10 mer寡核苷酸的质谱图。结果表明，纯度越高，去质子化基峰离子的信号就越强。此外，[M-2H+]²⁻电荷态下的钠和钾加合物形成量减少到为二分之一。将谱图叠加并归一化至基峰高度的结果表明，使用纯化的IonHance HFIP时，钠和钾加合物形成量相对减少。

图2.10~60 mer ssDNA ladder（P/N：186009449）的IP-RP-LC-UV-MS分析。A. LC-MS分析后得到的ssDNA ladder的TIC（总离子流色谱图）和UV色谱图。B. 在14.4分钟处洗脱的10 mer分子的质谱图，比较了使用IonHance HFIP（红色）和未蒸馏HFIP（黑色）时的电荷态分布。右图为归一化至[M-2H+]2-基峰（用*表示）的图，突出显示了蒸馏版IonHance HFIP与未蒸馏版IonHance HFIP相比，钠和钾加合物含量降低（质谱图的红色与黑色迹线）。

将IonHance HFIP与其他市售LC-MS级HFIP试剂进行比较时，也观察到这些优势。比较时，使用经过甲酸酸化的25:25:25:25 MeOH:ACN:IPA:H2O混合溶液冲洗LC-MS系统过夜。使用含有供应商S HFIP的IP-RP流动相分析样品。在切换为IonHance HFIP之前，再次使用上述混合溶液冲洗LC-MS系统过夜。使用相同的沃特世认证玻璃瓶储存流动相，在用双蒸水清洗两次后使用。也可考虑使用经认证的LDPE容器（P/N：186009110）储存流动相。图3研究了100 mer寡核苷酸分析物在相应LC-MS条件下运行的结果。图中显示了每种示例试剂的原始质谱图、基峰电荷态离子的放大图，以及去卷积质谱图。使用IonHance HFIP时，数据质量显著提升。

‡基于重量，以十亿分之一(ppbw)为单位

注：(<)表示低于LOD
图3. 使用ACQUITY Premier BEH C18 300 Å 1.7 µm 2.1 × 50 mm寡核苷酸分析专用柱（P/N：186010539）对100 mer寡核苷酸标准品进行IP-RP-LC-MS分析。去卷积质谱图突出显示了供应商S HFIP和IonHance HFIP的加合物情况。

结论

LC-MS数据质量与流动相试剂的纯度直接相关。IonHance HFIP (186010781)是一种高纯度流动相添加剂，旨在提高LC-MS法用于寡核苷酸分析的性能。IonHance HFIP采用专有的纯化工艺，可确保钠(<100 ppb)和钾(<100 ppb)含量保持在极低的水平。因此，用IonHance HFIP配制的流动相能够可靠地生成钠和钾加合物水平较低的质谱图。这一水平的降低有助于提高质谱图数据质量、减少加合物形成，并增强信号清晰度。

在使用10 mer和100 mer寡核苷酸标准品的比较研究中，我们发现IonHance HFIP可显著减少钠加合物和钾加合物的形成。数据质量的提升简化了解析过程并增加了可信度，对于经常进行离子反相LC-MS分析的实验室而言，IonHance HFIP是一个很好的选择。

参考资料

  1. Donegan, M., Nguyen, J. M., & Gilar, M. (2021).Effect of Ion-Pairing Reagent Hydrophobicity On Liquid Chromatography and Mass Spectrometry Analysis of Oligonucleotides. Journal of Chromatography A, 1666, 46286.
  2. Guilherme J. Guimaraes, Jack G. Saad, Vidya Annavarapu, and Michael G. Bartlett (2023) Mobile Phase Aging and its Impact on Electrospray Ionoization of Oligonucleotides.

特色产品

720008540ZH，2024年9月

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