使用100 mm亚2 µm色谱柱以更快的速度进行mAb HMWS的SEC-UV分析
摘要
本文介绍了使用快速、简便的单柱体积排阻色谱(SEC)方法，能够在仅1.6~1.4分钟（分析37~43次/h）内完成单克隆抗体(mAb)样品中的高分子量物质(HMWS)分析。该方法利用一根长100 mm，填充1.7 µm颗粒的SEC色谱柱，以高线速度获得理想柱效，从而在单体与二聚体HMWS之间提供基线分离(Rs > 1.5)。
本文所述的高通量(HT) SEC-UV方法使用ACQUITY™ Premier SEC蛋白分析专用柱(250 Å, 1.7 µm, 4.6 × 100 mm)，流速设置为0.75或0.9 mL/min，并检测UV吸光度(280 nm)。在此流速下，ACQUITY Premier UPLC ™系统上进行了1500个进样循环，展示了色谱柱的性能和稳健性。
优势
- 使用SEC-UV方法快速分析经蛋白A纯化的细胞培养样品、上游纯化样品和配方稳定性样品中的mAb HMW和约 50 KDa LMW大小异构体，每次分析只需1.6或1.4分钟
- 展示色谱柱在超过1500次分析中的稳健性
简介
HMWS mAb杂质可能会对治疗蛋白的安全性和有效性产生不利影响1。之前的研究已证明，长150 mm（内径4.6 mm）的ACQUITY Premier SEC 250 Å、1.7 µm和2.5 µm蛋白分析专用柱可提供稳健、高分离度的分离结果，以及高通量的SEC分析能力2。 该研究指出，尽管1.7 µm粒径色谱柱在HMWS分析中表现出足够的效率，但由于柱压过高，限制了其最大化高通量能力。
因此，我们研究了缩短色谱柱长度（100 mm和50 mm）以提高样品通量的实用性。研究结果表明，对于mAb HMWS的高通量分析，100 mm的柱长在速度与分离效率之间是一个合理的折衷选择。而50 mm色谱柱的柱效较低且更容易受到LC系统扩散的影响，严重限制了该色谱柱在此类应用中的实用性。需要注意的是，这些mAb样品的高通量SEC分离效率下降通常会阻碍监测典型水平的Fc:Fab（约100 KDa）低分子量物质(LMWS1)，但仍然可以观察到Fc和Fab结构域（约50 KDa，LMWS2）。
在推荐的最大流速下运行1.7 µm (100 mm)色谱柱与1.7 µm (150 mm)色谱柱和2.5 µm (150 mm)色谱柱，进行性能比较。此外，还在最大操作压力下评估了1.7 µm (100 mm)和2.5 µm (150 mm)色谱柱的性能。以推荐的最大流速(0.75 mL/min)进行1000次进样，然后以推荐的最大色谱柱压力（6000 psi或414 bar，0.9 mL/min）额外进行500次进样，生成色谱柱使用寿命数据。
应用优势
- 使用SEC-UV方法快速分析经蛋白A纯化的细胞培养样品、上游纯化样品和配方稳定性样品中的mAb HMW和约50 KDa的LMW大小异构体，每次分析只需1.6或1.4分钟
- 展示色谱柱在超过1500次分析中的稳健性
实验
样品描述
NISTmAb RM-8671纯溶液(10 mg/mL)。
LC方法条件
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LC系统： |
ACQUITY Premier UPLC，配备四元溶剂管理器(QSM)和CH-A柱温箱 |
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检测： |
ACQUITY UPLC TUV检测器，配备5 mm钛合金流通池, 波长：280 nm，数据采集速率：20~40 pt/s |
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样品瓶： |
聚丙烯12 × 32 mm螺口瓶，带瓶盖和预切割PTFE/硅胶隔垫，容积300 µL，100个/包（P/N：186002639） |
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色谱柱： |
ACQUITY Premier SEC蛋白分析专用柱, 250 Å, 1.7 µm, 4.6 × 100 mm（P/N：186011018） ACQUITY Premier SEC蛋白分析专用柱, 250 Å, 1.7 µm, 4.6 × 150 mm（P/N：186009959） ACQUITY Premier SEC蛋白分析专用柱, 250 Å, 2.5 µm, 4.6 × 150 mm（P/N：186009963） |
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柱温： |
25 °C |
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样品温度： |
6 °C |
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进样体积： |
0.5或0.8 µL，如所示 |
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流速： |
0.5~1.0 mL/min，如所示 |
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流动相： |
1.5倍浓缩，不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)（Sigma-Aldrich货号D1408），经0.1 µm无菌过滤（Thermo Scientific制造商编号5670010） |
数据管理
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色谱软件： |
Empower™ 3 (FR 4) |
结果与讨论
方法开发
虽然之前的结果表明，Premier SEC色谱柱可以使用DPBS作为流动相分析一系列mAb生物类似药，但在该条件下分析NISTmAb，HMWS的回收率较低3。 因此，我们使用DPBS 1倍至2倍的稀释水平快速优化了NISTmAb的流动相条件。在1.25× DPBS及更高浓度下，观察到HMWS多聚体形式的回收率最高。因此，为提高方法稳健性，最终采用1.5× DPBS作为流动相。
方法评估
研究中评估了1.7 µm (150 mm)、2.5 µm (150 mm)和1.7 µm (100 mm)色谱柱在最大推荐流速下的性能（图1）。此外，还评估了2.5 µm (150 mm)和1.7 µm (100 mm)色谱柱在更高流速下接近各自柱压上限时的性能。评估的分离属性包括主要mAb HMWS1（主要是二聚体形式）与mAb单体之间的峰谷比(P/V)。由于HMWS2（主要是多聚体）的大小异质性会对半高分离度(RHH)造成明显的混杂影响，因此使用P/V代替RHH。还应注意的是，由于HMWS1和单体之间的分离度(RHH=2.26)大于基线分离度，并且两个峰之间存在洗脱的痕量大小异构体，因此1.7 μm (150 mm)色谱柱测得的P/V值的参考价值有限。本研究还评估了HMWS1和HMWS2杂质的总量以及LMWS2 (~50 KDa)的定量，但在这些条件下LMWS1 (~100 KDa)无法可靠定量。
图1中展示的色谱结果趋势与预测趋势一致，即随着填料粒径减小、色谱柱长度增加和流速降低，SEC分离度增加。此外，总HMWS的相对丰度为2.92%~3.04%，痕量LMWS2的相对丰度为0.16%~0.20%，定量结果一致(n=2)。
图1.NISTmAb的HT SEC分离结果。流动相为1.5× DPBS，150 mm色谱柱和100 mm色谱柱的进样体积分别为0.8 μL和0.5 μL。色谱柱和流速如下：A) 1.7 µm (150 mm)色谱柱，流速为0.50 mL/min，B) 2.5 µm (150 mm)色谱柱，流速为0.5 mL/min，C) 2.5 µm (150 mm)色谱柱，流速为1.00 mL/min，D) 1.7 µm (100 mm)色谱柱，流速为0.75 mL/min；E) 1.7 µm (100 mm)色谱柱，流速为0.90 mL/min。UV吸光度检测频率为20~40 Hz。
研究中还比较了各色谱柱的最短分析时间。指定的分析时间包括额外分配的0.3 min（供自动进样器执行一次样品进样）和交错SEC运行（在LMWS洗脱并重新建立基线后开始下一次进样）的时间。表1汇总了1.7 µm (100 mm)色谱柱在有效HT HMWS分析能力方面的重要比较结果。值得注意的是，1.7 µm (100 mm)色谱柱的分析时间不到1.7 µm (150 mm)色谱柱的一半，但分离度有所下降，同时其分析速度比2.5 µm (150 mm)色谱柱的最大通量快20%，且分离度明显更高。
表1.分析时间针对交错进样，包括0.3 min自动进样器执行进样的时间。
方法可靠性
以推荐的最大流速(0.75 mL/min)执行1000个进样循环，然后在推荐的最大柱压（6000 psi或414 bar，流速为0.9 mL/min）下额外进行500次进样，以此展示1.7 µm (100 mm)色谱柱的使用寿命。本研究中的流动相经过0.1 µm无菌过滤，然后以建议的离心力10,000 x g离心样品1~2 min，以去除肉眼不可见和较大的颗粒，从而延长色谱柱使用寿命。经过全部1500次进样后，HMWS的分离度保持不变（图2）。但是，在0.9 mL/min流速下执行500次进样后，观察到低水平拖尾现象略有增加。这些结果表明，该色谱柱在0.75 mL/min的流速下能够保持稳定的性能，而在0.9 mL/min的流速下，性能略有下降，因此，两次进样之间的分析时间缩短至1.4~1.6 min。
图2.在以0.75 mL/min的流速执行1000个循环进样（上图），然后以0.90 mL/min的流速执行500个进样循环（下图）之后，ACQUITY™ Premier SEC 250 Å, 1.7 µm, 4.6 × 100 mm蛋白分析专用柱的稳健性。流动相为1.5× DPBS，进样体积为0.5 μL。UV吸光度检测频率为20~40 Hz。
结论
快速SEC法对于支持生物治疗性细胞培养和纯化工艺以及原料药和药物制剂的开发很有用。本文介绍了使用ACQUITY Premier SEC (250 Å, 1.7 µm, 4.6 × 100 mm)蛋白分析专用柱，在流速为0.75和0.90 mL/min的条件下，使用高通量（运行时间1.6分钟和1.4分钟）SEC-UV方法进行的单克隆抗体HMWS和LMWS2（约50 KDa）片段分析。
此外，研究中还展示了色谱柱的使用寿命性能，以0.75 mL/min的流速执行1000次进样，然后以0.90 mL/min的流速执行500次进样。本次评估使用的流动相经过0.1 µm无菌过滤，并在10,000 x g下离心样品1~2 min，此举可显著降低色谱柱污染的可能性。
参考资料
- Moussa EM, Panchal JP, Moorthy BS, Blum JS, Joubert MK, Nari LO, Topp EM.Immunogenicity of Therapeutic Protein Aggregates.J Pharm Sci.2016 Feb;105(2):417–430.
- Stephan M. Koza和Ying Qing Yu.使用与UPLC™和HPLC兼容的MaxPeak™ Premier SEC蛋白分析专用柱对单克隆抗体的大小异构体进行快速分析, 720007584ZH, 2022年3月.
- Stephan M. Koza, Hua Yang, 和Ying Qing Yu.在生理pH值和离子强度下通过现代体积排阻色谱法分离生物类似药抗体. 720007484ZH, 2022年1月.
720008292ZH，2024年3月
