盐酸萘甲唑啉、马来酸非尼拉敏及相关物质分析方法的缩放和迁移至ACQUITY™ Arc™系统

在不同粒径色谱柱上进行分析方法缩放并在系统之间迁移时，证明结果的等效性对于确保产品一致性和法规合规性至关重要。本研究介绍了盐酸(HCl)萘甲唑啉和马来酸非尼拉敏活性药物成分(API)及其相关物质分析方法的缩放和迁移。我们使用等效的填料将在1.7 µm (2.1 x 100 mm)色谱柱上开发的方法按几何级数缩放至2.5 µm (4.6 x 150 mm)色谱柱，并从ACQUITY™ UPLC™ H-Class Plus系统迁移至ACQUITY Arc™系统。通过评估色谱分离结果、系统适应性数据以及API和相关物质含量的分析结果，证明方法性能相当。

优势

• Waters™方法转换计算器可计算操作参数，在不同粒径的色谱柱之间实现等效的色谱性能，顺利完成方法的缩放
• 迁移时将系统延迟体积和柱外扩散的差异考虑在内，可提高色谱系统之间方法缩放和迁移的成功率

使用低扩散液相色谱(LC)系统在亚2 μm粒径色谱柱上开发的分析方法可提供快速、高通量的分析，并且能够缩短方法开发时间。如果支持生产过程的质量控制实验室未配备低扩散性系统，则需要将这些方法缩放，以适用于在更高扩散性HPLC系统上进行分析的更大粒径¹。

在不同仪器之间缩放和迁移方法的目标是获得相同的色谱分离和方法性能。为确保色谱分离质量，必须考虑诸多因素。保持柱长(L)与粒径(dp)的比率不变，可维持方法的分离能力。此外，与采用亚2 µm颗粒的系统相比，专为较大粒径设计的HPLC系统通常具有更大的延迟体积和柱外扩散性。这些差异将影响色谱分离，在缩放方法时必须考虑在内²。

本研究将在1.7 μm粒径色谱柱上开发的盐酸萘甲唑啉、马来酸非尼拉敏及相关物质的分析方法缩放至2.5 μm粒径色谱柱，并将该方法从ACQUITY UPLC H-Class Plus系统迁移至ACQUITY Arc系统。方法缩放和迁移是否成功通过检查色谱分离结果、系统适应性结果和分析结果进行衡量。

标准品溶液

研究中使用的化合物（表1）购自Sigma-Aldrich和Toronto Research Chemicals (TRC)。

使用甲醇配制浓度为4.0 mg/mL的单标储备液。用80:20的水/甲醇稀释剂稀释储备液，制备用于方法迁移实验的混标溶液，其中盐酸萘甲唑啉和马来酸非尼拉敏活性成分的浓度为0.1 mg/mL，相关物质的浓度为10 µg/mL。 

眼科样品溶液

使用80:20水/甲醇稀释剂制备眼科样品溶液，其中马来酸非尼拉敏的工作浓度为500 µg/mL，盐酸萘甲唑啉的工作浓度为40 µg/mL。

表2汇总了1.7 µm和2.5 µm粒径色谱柱的方法条件。使用沃特世方法转换计算器对流速、进样体积和梯度洗脱进行几何级数缩放（从1.7 µm放大至2.5 µm）³。

使用Empower软件采集和处理数据。Empower项目中提供了使用报告模板生成的汇总报告。

LC系统延迟体积

与设计用于2.5-5 µm颗粒的系统相比，设计用于亚2 µm粒径色谱柱的系统通常体积更小。系统体积的差异可能导致梯度方法的色谱分离效果较差和峰畸变。因此，在不同LC系统之间迁移方法时，为了达到相同的色谱分离效果，必须考虑系统延迟体积的影响²。 白皮书中介绍了测定LC系统延迟体积的推荐流程⁴。

方法缩放

为了保持方法的分离能力，色谱柱柱长(L)与粒径(dp)的比率必须与原始方法相同（或非常相似）。为保持相同的色谱分离质量，我们对其他参数（包括流速、进样体积和梯度时间）进行了几何级数的缩放。 

在本研究中，我们使用方法转换计算器³将马来酸非尼拉敏和盐酸萘甲唑啉API相关物质的分析方法从1.7 µm粒径放大至2.5 µm粒径。原始方法使用长100 mm、粒径1.7 µm的色谱柱，得到的L/dp = 58,824。目标方法选择长150 mm、粒径2.5 µm的色谱柱，L/dp为60,000。由于ACQUITY Arc系统的延迟体积(1.1 mL)高于ACQUITY UPLC H-Class Plus系统(0.4 mL)，因此目标方法的梯度开始时间进行了延迟，以保持色谱分离的完整性。在ACQUITY Arc系统的仪器方法中使用“智能梯度起点”，将梯度调整为在进样后1.2分钟开始运行（图1）。“智能梯度起点”功能可补偿系统延迟体积的差异，无需手动调整梯度表。

对于含有100 µg/mL马来酸非尼拉敏和盐酸萘甲唑啉API以及10 µg/mL相关化合物的样品，两套系统获得的色谱数据如图2所示。  ACQUITY Arc系统所得的色谱分离结果与ACQUITY UPLC H-Class Plus系统中得到的结果相近。此外，ACQUITY Arc系统所得相关物质的相对保留时间(RRT)和色谱峰之间的USP分离度(Rs)与ACQUITY H-Class Plus系统所得结果一致（表3）。使用Empower软件，通过比较每种相关物质与相关API的保留时间，计算出RRT值。RRT值可辅助色谱分离中的峰鉴定，因此，在不同粒径的色谱柱和不同的LC系统之间转换方法时，必须保证RRT值一致。

性能验证：系统适应性

通过测量使用10 µg/mL标准品进行六次重复进样的重现性，评估在配备2.5 µm色谱柱的ACQUITY Arc系统上运行方法的性能。ACQUITY Arc系统所获得的峰面积和保留时间重现性非常出色，与ACQUITY UPLC H-Class Plus系统所获得的结果相当（图3）。ACQUITY Arc系统在关键峰对之间获得了相同的USP分离度：Naph-Imp D与Naph-Imp A之间为1.9，Naph-Imp B与Naph-Imp C之间为1.8。

眼科制剂分析

图4所示为在配备1.7 µm色谱柱的ACQUITY UPLC H-Class Plus系统和配备2.5 µm色谱柱的ACQUITY Arc系统上采集含500 µg/mL马来酸非尼拉敏和40 µg/mL盐酸萘甲唑啉的眼科样品溶液所得代表性色谱图。

我们计算了眼科样品溶液中的API含量和相关物质含量，并在不同系统之间进行了比较。非尼拉敏和萘甲唑啉的工作浓度分别为500 µg/mL和40 µg/mL时，生成浓度范围为80%~120%的校准曲线，采用此校准曲线定量分析样品，确定API含量或回收率百分比(%)。采用Empower软件，通过比较所检出相关物质与相关API的峰面积来确定相关物质含量（%杂质）的分析结果。ACQUITY Arc系统生成的API和相关物质含量的分析结果与ACQUITY UPLC H-Class Plus系统获得的数据相当（图5和图6）。 

一种用于分析马来酸非尼拉敏和盐酸萘甲唑啉API及其相关物质的分析方法成功从1.7 µm粒径色谱柱放大至2.5 µm粒径色谱柱，并从ACQUITY UPLC H-Class Plus系统迁移至ACQUITY Arc系统。ACQUITY Arc系统上的色谱分离、相对保留时间(RRT)值、系统适应性和分析结果与ACQUITY UPLC H-Class Plus系统上获得的数据相当。

不同LC平台之间能否成功实现方法的缩放和迁移可能受系统特性影响，针对这些差异进行适当调整可提高获得等效分离度和性能的成功率。

1. Dong MW.Ultrahigh-Pressure Liquid Chromatography, Part III: Potential Issues: This Installment on Ultrahigh-Pressure Liquid Chromatography (UHPLC) Review The Potential Problems That May Be Encountered Using HPLC Systems and Methods, And Proposes Strategies For Their Migration.LC-GC North America, 35-11, 2017.
2. Hong H, McConville PR. 什么是延迟体积和柱外体积？它们如何影响方法转换？沃特世白皮书，720005723ZH，2018。
3. 沃特世方法转换计算器。https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=134891632&type=DWNL
4. 沃特世公司，《梯度延迟（延迟体积）测量方案》。沃特世应用文集，2013，第67-69页。