RNasi RapiZyme
Digestione regolabile dell’RNA per un sequenziamento LC-MS ottimizzato
L’mRNA e l’sgRNA CRISPR richiedono una caratterizzazione decisa per confermarne l’identità, le sequenze e la purezza. Queste molecole di RNA sono i candidati principali per l’analisi LC-MS data la loro complessa funzionalità, le modifiche e le varianti presenti. Date le loro dimensioni, la digestione con un’endonucleasi come una RNasi spesso viene eseguita prima dell’iniezione. I prodotti di digestione risultanti possono essere facilmente rivelati utilizzando la cromatografia in fase inversa a coppia ionica (IPRP) o la cromatografia a interazione idrofila (HILIC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS).
Waters RapiZyme MC1 e RapiZyme Cusativin offrono un clivaggio dell’RNA controllato e riproducibile in un’ampia gamma di siti dinucleotidici. Le RNasi RapiZyme producono una serie di frammenti di RNA esclusivi con sovrapposizione complementare. Per gli utilizzatori di sistemi LC-MS, vengono offerte digestioni regolabili che migliorano l’affidabilità nell’identificazione dei picchi e di conseguenza incrementano la copertura delle sequenze e le informazioni molecolari. Ciascuna provetta include 10 000 unità di RNasi RapiZyme, un reagente enzimatico sufficiente a completare fino a 100 reazioni di digestione di campioni di RNA da 10 µg.
- Raggiungi la massima copertura della sequenza per mRNA e sgRNA
- Utilizza le RNasi progettate specificamente per l’analisi LC-MS
- Elimina la necessità di denaturanti e inibitori delle RNasi durante l’esecuzione della digestione
- Ottieni una sensibilità e un segnale e più puliti grazie ai prodotti a base di fosfato ciclico
- Accelera lo sviluppo e l’analisi di terapie a base di RNA
RNasi RapiZyme
Specifiche
Panoramica
- Migliora i risultati con una copertura più completa delle sequenze per la caratterizzazione LC-MS dell’RNA
- Migliora l’efficienza con reagenti enzimatici altamente attivi e a purezza elevata fino a 100 reazioni a seconda del substrato
- Semplifica l’analisi utilizzando un protocollo di digestione pronto per l’automazione
- Evita la digestione eccessiva e la contaminazione dello strumento/colonna con un’inattivazione a caldo affidabile che non richiede reagenti inibitori aggiuntivi
- Individua i target di residui di uridina o citidina utilizzando due specificità enzimatiche
- Massimizza la sensibilità e semplifica l’interpretazione dei dati con le proprietà di digestione enzimatica integrate in waters_connect MAP Sequence
- Associa con l’additivo in fase mobile IonHance HFIP per ridurre di 2 volte gli addotti indesiderati di sodio e potassio
Uso consigliato: per una migliore copertura delle sequenze per le terapie a base di mRNA e sgRNA CRISPR.
Un’impresa da digerire
RapiZyme MC1 e RapiZyme Cusativin hanno specificità di clivaggio riproducibili. Per studiare RapiZyme MC1 e RapiZyme Cusativin sono stati applicati substrati di RNA sottoposti a quenching a doppia marcatura. In seguito al clivaggio da parte della RNasi, un substrato di prova marcato con FAM viene separato dal relativo coniugato Black Hole Quencher. L’evento digerito viene quindi rivelato utilizzando tecniche basate sull’assorbanza che forniscono una misurazione quantitativa per il clivaggio on-target. Un controllo negativo, un substrato marcato HEX (ad es. poli-A) viene inoltre applicato per valutare il clivaggio off-target. Il rapporto FAM/HEX fornisce informazioni dettagliate sull’attività di ciascun enzima e può essere eseguito in varie condizioni, tra cui temperatura, pH, composizione del tampone, unità enzimatiche e tempo. Queste analisi sono state eseguite per determinare le condizioni di reazione ottimale per RapiZyme Cusativin e RapiZyme MC1.
Entriamo nello specifico
RapiZyme MC1 e RapiZyme Cusativin sono RNasi a purezza elevata e altamente attive che offrono specificità di clivaggio complementari. Questi enzimi ricombinanti regolabili sono progettati per accelerare lo sviluppo e l’analisi di terapie a base di RNA facilitando la digestione controllata di oligonucleotidi di sintesi, mRNA e sgRNA. RapiZyme MC1 mostra i tassi di digestione più selettivi ed efficienti a legami dinucleotidici [A/U/C]pU a pH 8, mentre RapiZyme Cusativin è sottoposto a clivaggio in modo più efficiente e selettivo con sequenze dinucleotidiche Cp[U/A/G] a pH 9. Parametri quali la temperatura, il pH e il rapporto tra enzima e substrato possono essere modificati per ottimizzare gli effetti specifici del campione.
Copertura delle basi
RapiZyme MC1 e RapiZyme Cusativin mostrano una preferenza per il clivaggio e il docking del substrato in corrispondenza di posizioni specifiche dei dinucleotidi. RapiZyme MC1 ha la tendenza a effettuare il clivaggio all’estremità 5’ dell’uridina e RapiZyme Cusativin all’estremità 3’ della citidina. Entrambi gli enzimi mostrano prodotti di clivaggio controllati e ripetibili. La natura idiosincratica di queste RNasi comporta una digestione parziale, generando prodotti più lunghi oltre a frammenti esclusivi e sovrapposti. La digestione parziale, che fornisce una miriade di informazioni, crea frammenti maggiormente diversificati da esaminare per la determinazione strutturale. L’interpretazione dei dati può essere accelerata con strumenti informatici come waters_connect MAP Sequence, che prevede frammenti in silico (mRNA Cleaver) in base alle proprietà di clivaggio note dell’enzima scelto e mappa i dati osservati sulla sequenza della molecola di RNA esaminata.
