ピーク形状の経時変化

このシリーズの最初の 3 つのパートで説明したように、ピーク形状の異常は HPLC 分析でよく遭遇する問題です。ピークは、理想的には、左右対称でガウス形状をしている必要があります [D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。ピークの対称性は、図 1 に示すように、USP テーリング係数（T）を計算することで定量できます。テーリング係数 1 は完全な対称性を示し、値が 1 より小さい場合はフロンティング、1 より大きい場合はテーリングと呼ばれます。多くの分析法では、すべてのピークのテーリング係数が指定範囲内である必要があります。テーリング係数が 1 から大きく外れると、近接して溶出するピークの分離度が低下し、波形解析が困難になる場合があります [D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。また、ピークの対称性が悪いと、一般にピークが本来より幅広くなり、ピーク高さが低下します。低濃度の分析種を検出および定量するアプリケーションでは、これによって、結果の精度が低下するだけでなく、定量限界および検出限界も悪影響を受ける場合があります。

多くのアプリケーションでは、1 つのメソッドを繰り返し使用してサンプルグループを分析します。正確な結果を確保するには、一連の分析の間で、カラムで一貫したピーク幅とテーリング係数が得られることが重要です。しかし、実際には必ずしもこれが実現しないことがあります。図 2 に示す例では、4 種類の化合物のアイソクラティック分離において、100 回の注入後にピーク幅とピークの対称性が変化していることがわかりました。C₁₈ シリカカラムを、pH 7.0 のリン酸カリウムバッファーとメタノール（35:65 v/v）を含む移動相およびカラム温度 40 ℃ で使用しました。最初の 3 つのパートで説明したように、ピークの対称性の変化には、HPLC システム、移動相、サンプル、カラムの問題を含む、いくつかの原因が考えられます [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385–420]。以前説明したように、トラブルシューティングの良い出発点は、クロマトグラムを注意深く分析して、ピーク形状の変化がすべてのピークで見られるか、あるいは一部のピークのみで見られるかを観察することです。図 2 に示すクロマトグラムにおいて、ノルトリプチリン（ピーク 1）で最大の変化が見られ、アミトリプチリン（ピーク 4）ではより小さい変化が見られます。これら 2 本のピークでは、保持時間の著しい増加も明らかです。他の 2 本のピーク（ピーク 2 の 2-メチルナフタレンとピーク 3 のアセナフテン）では、さらに小さな変化が見られます。ノルトリプチリンとアミトリプチリンは塩基性化合物であり、2-メチルナフタレンとアセナフテンはイオン化しません。図 2B のように、塩基性化合物のピークのみでテーリングと保持時間の増加が見られる場合は、移動相やカラムの変化などが原因である可能性があります。図 2B のクロマトグラムに見られる変化の原因がこれらのうちどれかを判断するために、カラムを同じ種類の新しいカラムと交換しました。同じ移動相を使用して、図 2C に示すクロマトグラムが得られました。このクロマトグラムでは、元のカラムで当初得られていた分離と同様の分離が見られ、100 回目の注入におけるテーリングの増加の原因がカラムの変化であることを示しています。

カラムは、推奨範囲内の温度（20 ～ 45 ℃）および pH（2 ～ 8）で使用していたため、この比較的急激な劣化は予想していませんでした。しかし、有機溶媒（メタノール）を添加した場合、水系バッファーの pH は変化することを考慮に入れておくことが重要です。pH 7.05 のリン酸水溶液を等量のメタノールで希釈すると、pH が 8.29 に上がったことが報告されています [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal.Chem.72 (2000) 1802–1809]。図 2 のクロマトグラムを得るのに使用した移動相には 65% メタノールが含まれているため、移動相の pH はさらに高く、推奨限度の 8 を超えていると予想されます。推奨限度を超える移動相 pH を使用すると、固定相の加水分解が起き、結合基の喪失やさらなるさらなるシラノールの生成、効率の低下に至る場合があります [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]。これが、図 2B に見られるピーク形状と保持の変化の原因である可能性があります。

pH が 8 を超える移動相を使用する場合、有機-無機ハイブリッド粒子を充塡したカラムの方が C₁₈ シリカカラムよりも頑健な選択肢です [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal.Chem. 75 (2003) 6781–6788]。このことを実証するため、ハイブリッド粒子カラム（XBridge BEH C₁₈）で同じメソッドを使用したところ、図 3 に示した結果が得られました。ハイブリッド粒子のカラムはアルカリ性での安定性が向上しているため、120 回の注入にわたってピーク形状に大きな変化は見られませんでした。これらの結果は、特に結合相の推奨 pH および推奨温度の限度近くでカラムを使用する場合、結合相の加水分解が原因でピーク形状が変化する場合があることを示しています。重要なこととして、移動相 pH がカラムの推奨範囲内であるかどうか確認する際は、水系バッファーの pH に有機溶媒が及ぼす影響を考慮する必要があります。