BioResolve RP mAb カラムによる mAb サブユニットの LC-MS 特性解析

本テクニカルブリーフでは、BioResolve RP mAb Polyphenyl によるmAbサブユニット分離の改善を示します。従来の逆相LC-MSの分析手法を用いて、サブユニットレベルの分析能力を増大させます。改善されたクロマトグラフィー分離、ロード量の最適化により、mAbの構造や機能についてより確かな洞察が得られ、より確実なタンパク質の多様性の解明が可能となります。

利点

Waters BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムによる mAb サブユニットの LC-MS 分析における改善

逆相クロマトグラフィー（RPLC）を高分解能質量分析計と組み合わせた分析（RPLC-HRMS）は、モノクローナル抗体（mAb）医薬品の分子量を決定するツールとして日常的に使われる方法です。精密質量情報が得られることに加え、不純物やタンパク質の修飾に関する情報が得られる点で、HRMS は魅力ある装置と言えます。タンパク質修飾の多くは抗体医薬品の安全性や薬効に大きな影響を与え得る重要品質特性（CQA）であると考えられています。LC-HRMS はサブユニットレベルでの mAb の特性解析にも有用で、迅速でシンプルな分析法を用いて同一性を確認し、製品の品質を確保するために要求されるドメイン特有の CQA の相対的な存在量を求めることが可能です^1–2。

上述した同一性は LC-MS データをデコンボリューションして得られる質量によって決定されます。この場合、微量しか含まれない CQA 分析種の MS シグナルは、より多量に含まれるイオンによりイオン化抑制を受けることが多く、確実な検出は難しいものとなっています。このため、クロマトグラフィー上の分離を強化した逆相 LC カラムは、LC-MS に基づくサブユニット分析全体の性能に大きなインパクトを与えます。さらに、クロマトグラフィーの改善は分析時間の短縮につながり、データ解析も容易にします。

ここでの mAb サブユニットの特性解析には、ACQUITY UPLC H-Class Bio および SYNAPT G2-Si HDMS を使用しました。本アプリケーションでは、表面多孔性のソリッドコアシリカを基材とし充塡剤内でのタンパク質試料の拡散を抑えることにより、全多孔性カラムと比較してよりシャープなピークが得られる、分析者の要望に合致した BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムによるメリットを示します。充塡剤のポアサイズは 450Å、粒子径は 2.7 µm であり、本カラムの様々な特性がインタクト mAb、mAb サブユニットの分析において、極めて優れた分離、回収率、低キャリーオーバーを実現させます^3-4。

Waters mAb サブユニットスタンダード（製品番号：186008927）のクロマトグラム例を示しました（図 1）。本スタンダードは NIST mAb 標準物質 8671 を IdeS で消化、還元した凍結乾燥品で、分析の指標として、また予備試験やシステム適合性試験に使用できます。  本スタンダードに含まれる Fc/2、LC、Fd'、各フラグメントの理論的質量は、23790.81 Da、23127.51 Da、25705.89 Da です。これら 3 種類のサブユニットを分析時間 10 分でベースライン分離することができました（図 1）。図 1 上段が 2.1 × 50 mm の BioResolve RP mAb Polyphenyl カラム、下段が 1.7×50 mm の代表的な C4 カラムのデータです。

図 1 に示した通り、BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムでは、MS に適した移動相である 0.1% ギ酸、0.02% TFA のいずれにおいても良好な分離が得られました。BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムの優れた分離能力により、従来の C4 カラムと比較し、ピーク幅に改善が見られ、不純物もベースラインで分離されています。

このような良好な結果を得るために、ロード量を最適化し 0.5 µg としています。実験から得られた、2.1 mm 内径カラムの推奨ロード量は 0.05～2.50 µg と幅をもたせてあり、MS 検出器が飽和することなく低濃度の分析種が検出できる条件を検討することが重要です。これらの条件における各サブユニットの抽出イオンクロマトグラムはシャープでベースライン分離を達成しており、図 1 に示した 50% 高さでのピーク幅はこの所見を裏付ける結果となりました。これらのシャープなピークは、図 2 に示した Fc/2 ピークのスペクトルのように高品質のデコンボリュートされたマススペクトルを生み出します。このような解析を他のピークに対しても行い、得られた質量、mAb サブユニットスタンダードの主要なタンパク質修飾についての相対存在比率のデータをまとめました（表 1）。

ここで示した分析例におけるクロマトグラフィー分離は、図 1 に示した BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムデータのピーク 1～6 のように低濃度のピークに対しても発揮されます。BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムによってもたらされるベースライン分離は、MS による、製品に関連した不純物の同定を助けます。例えば、ピーク 2 とピーク 5 は、スタンダードに存在する平均質量 9832.2 Da の Fd' サブユニット（PQ［1-88］D）のフラグメントであると考えられました。⁵

BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムは、分析者の要望に合わせた設計により、mAb サブユニット分離を改善することが可能です。本アプリケーションでは、BioResolve RP mAb Polyphenyl カラムが実際に従来の逆相 LC-MS 分析法に適用可能であり、サブユニットレベルの分析性能を向上させることを示しました。クロマトグラフィー分離の改善、ロード量の最適化により、mAb の構造や機能について、より確かな INSIGHT（洞察）を与えるより確実なタンパク質の多様性の解明が可能です。 

1.  Sokolowska, I.; Mo, J.; Dong, J.; Lewis, M. J.; Hu, P. Subunit mass analysis for monitoring antibody oxidation.mAbs 2017, 9 (3), 498–505.
2. Ranbaduge, N.; Shion, H.; Yu, Y. Q. Automated Protein Modification Characterization of the Intact and Subunit NIST Monoclonal Antibody Reference Standard with Waters UNIFI Scientific Information System 2017.720006085EN.
3. Nguyen, J., et al.Designing a New Particle Technology for Reversed Phase Protein Separations Through the Optimization of Diffusion Properties, Waters Application Note, 720006168EN, Jan 2018.
4. Nguyen, J., et al.A Novel Phenyl Bonded Phase for Improved Protein Reversed Phase Separation, Waters Application Note, 720006169EN, Jan 2018.
5. Formolo, T.; Ly, M.; Levy, M.; Kilpatrick, L.; Lute, S.; Phinney, K.; Marzilli, L.; Brorson, K.; Boyne, M.; Davis, D.; Schiel, J. Determination of the NISTmAb Primary Structure.In State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2.Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study, American Chemical Society: 2015; Vol.1201, pp 1–62.