穀物粉中の規制対象マイコトキシンの定量分析のための、Xevo TQ-XS および簡素化したサンプル前処理条件を用いた LC-MS/MS 分析法開発およびバリデーション

このアプリケーションノートでは、小麦粉中のマルチマイコトキシン定量用分析法のバリデーションについて説明します。この分析法は、様々な穀物粉に適用範囲が拡げられています。

アプリケーションのメリット

穀物および乾燥食品中の、最も重要かつ規制されているマイコトキシンを完全に一斉定量するための LC-MS/MS 分析法を開発できました。この分析法は迅速でシンプルなサンプル前処理戦略を使用しており、規制値および分析法の性能ガイドラインに適合します。

マイコトキシンは、様々な種類のカビによって産生される有毒二次代謝産物で、多くの農産物や加工食品で、畑または貯蔵中に様々な種類のカビによって産生される毒性二次代謝産物です^1,2。これらは、合成汚染物質、植物毒素、食品添加物、残留農薬よりもリスクが高い、食品中の最も重要かつ常在するリスクファクターとして位置付けられています³。

欧州委員会規則 No.1881/2006（および追加の修正案）⁴ により、様々な食品中のアフラトキシン B1、B2、G1、G2、フモニシン B1、B2、デオキシニバレノール、トキシン T-2 および HT-2、ゼアラレノンおよびオクラトキシン A の最大許容レベル（MPL）が設定されました。最新の EFSA の科学的意見として、ニバレノールの耐用一日摂取量（TDI）が 1.2 µg/kg/日と定められています⁵。ニバレノールの平均濃度が最も高い食品はオート麦、トウモロコシ、大麦、および小麦製品です。2018 年、RASFF ポータルでは、穀物中のマイコトキシン汚染について、25 件の重大な通知が出されました⁶。これらの理由から、当社はマイコトキシン汚染のリスクが高い食品とみなされている穀類ベースの食品を対象にした分析法開発に取り組みました。

ここでは、小麦粉中のマルチマイコトキシン定量用分析法のバリデーションについて説明します。この分析法は、様々な穀物粉に適用範囲が拡げられています。Waters Xevo TQ-XS タンデム四重極質量分析計を選択した理由は、最高な感度が得られるとともに、サンプル前処理プロセスが簡単になることで、分析時間全体が短縮できるためです。同位体標識された内部標準の使用を検討することにより、一般的に採用されている外部標準法や標準添加法よりも優れた性能が達成できました。分析法は、欧州委員会規則 No.401/2006 および SANTE ガイドラインに記載されている基準にしたがって評価されました^7,8。

サンプルの処理

粉末サンプル（0.500±0.005 g）を 5 mL プラスチック遠心チューブに量り取り、50 µL の内部標準混合液をスパイクしました。混合液に 1950 μL の抽出溶液（MeCN：H₂O 79:20 + 0.75% 酢酸 + 0.2% ギ酸）を加え、チューブを 10 秒間激しく振とうし、10 分間自動ボルテックスミキサーで混合しました（1300 パルス速度）。5,000 rpm（5311 g）で遠心分離した後、150 μL の上清を 2 mL LC バイアルに移し、1350 μL の希釈液（H₂O + 0.5% 酢酸+ 0.1% ギ酸）*を加えることで、最終的に 40 倍希釈しました。

*最終抽出物中に粒子状物質が存在する場合、ろ過のステップを次のように行いました：1mL の上清を 0.2 µm GHP シリンジフィルター（製品番号：WAT097962）でろ過し、ろ過後の抽出物 150 µL を LC バイアルに入れて希釈液で 1:10 に希釈した後、注入しました。

キャリブレーション用標準溶液の調製

H₂O：MeCN 95：5 + 0.5% 酢酸 + 0.1% ギ酸の溶媒組成を維持しつつ、個々のストック溶液を混合および希釈して該当する MPL に一致する濃度に調製し、目的の 12 種類のマイコトキシンを含む溶媒検量線を作成しました。一連の検量線の作成には、8 点（ブランクを除く）の検量線を用いました。マトリックスマッチド検量線は、同じプロトコルに従って、ブランクの小麦粉抽出物で希釈して作成しました。いずれの検量線についても、10 µL の混合内部標準溶液を各濃度 400 µL を含む LC バイアルに直接添加しました。

各化合物について 2 回のトランジションをモニターし、¹³C 標識異性体については 1 回のトランジションを使用しました（表 1）。コーン電圧とコリジョンエネルギーは、個々の化合物を含む別々の標準溶液を、溶出時のグラジエント組成と組み合わせて注入する際のマニュアルチューニングにより最適化しました。ソース電圧、ガス流量、温度は、最も感度の低い化合物に基づいて最適化しました。データは MassLynx v4.2 ソフトウェアを用いて取り込み、TargetLynx XS アプリケーションマネージャーで解析しました。

直線性、検出下限、定量下限（LOD および LOG）

分析法の直線性は、外部標準化アプローチと内部標準化アプローチの両方を使用して、テストした濃度範囲にわたって検証しました。検量線の作成には、1/x の重み付けを使用しました。

内部標準アプローチでは、比率［分析化合物のレスポンス/内部標準のレスポンス］を比率［分析化合物の濃度/内部標準の濃度］に対してプロットしました。すべての回帰式において、決定係数（R²）は 0.9941～1.0000 であり、全検量線範囲で残差は 20% 未満でした。この試験では、装置の定量限界（LOQ）として溶媒検量線の最低点を採用しました。一方、直線検量線範囲内の最低添加濃度を分析法の LOQ として採用しました。その後、10 種類のブランクサンプルの「調整した」標準偏差にそれぞれ係数 3 または 10 を掛けることにより、Eurachem のガイドライン⁹に従って分析法の LOD と LOQ を検証しました。ブランクマトリックスからシグナルが得られなかった場合、直線範囲内の最低濃度をスパイクした小麦粉サンプルを独立して 10 回繰り返し測定しました。また、装置の LOQ および分析法の LOQ に相当する両濃度において、10 を超えるシグナル対ノイズ比（S/N）が得られました。アフラトキシン化合物についての最低検出能を記録しました。ここで、LOD（溶媒標準から測定）は 0.75～0.93 pg/mL（カラムで 11～14 fg に相当）であることが分かりました。その他の目的のマイコトキシン化合物については、Xevo TQ-XS は 0.0075～1.5 ng/mL の濃度範囲（カラムで 0.1～22.5 pg に相当）で LOD を達成できました。

Xevo TQ-XS の優れた感度により、時間のかかる予備濃縮やクリーンアップのステップが不要になり、穀物マトリックスの溶媒抽出および希釈が簡単にできるため、ラボ全体の効率が向上するとともに、溶媒消費量が低減できます。

真度、日内再現性、マトリックス効果

抽出前に強化されたマトリックスを使用して測定されたパーセント回収率を、分析法の真度の推定値として採用しました。小麦粉に 12 種のターゲットマイコトキシンを 3 つの異なる濃度レベルでスパイクして、大部分の化合物の分析法 LOQ を包含し、関連する MPL を一括しました。

日内再現性条件下で行った、各濃度レベルでの 7 回の独立した繰り返し分析から、回収率（%）および相対標準偏差（RSD_r）を得ました。IUPAC では回収率と皮相回収率を区別しています（R_A）¹¹。 R_A（プロセス効率（PE）とも呼ばれる）は、分析プロセスから検量線を介して得られた測定値を、既知の値または理論値で除算した比率のことです。これは、分析法の全体的な回収率または総回収率とも呼ばれます。回収率（R_E）という用語自体は、分析化合物の分析プロセスの予備濃縮または抽出段階の収率を、元のサンプル中の分析化合物の量で除算して示すために使用されます。R_A の値には、R_E とマトリックス効果（ME）の両方が寄与します。

R_A (%) = (C₁ – C₀) / C_s * 100 ME (%) = b_M / b_S * 100 R_E (%) = R_A / ME * 100

ここで、C₁ は濃度 C_S のサンプルをスパイクした後の分析化合物の濃度計算値、C₀ はスパイクなしのサンプル中の分析化合物の濃度計算値、b_M および b_S はそれぞれ、マトリックスマッチド検量線および溶媒検量線の傾きです。皮相回収率、回収率、マトリックス効果はすべて表 3 に示しています。R_A も内部標準法（内部標準 R_A）で計算しました。図 2 は、内部標準溶液を用いた場合、皮相回収率（3 つのスパイク濃度での平均値）、つまりマトリックス効果と分析化合物のロスを併せたものが、95～105% の狭い範囲にあることを示しています。

回収率および RSD_r は、欧州委員会規則 No.401/2006、を改訂した欧州委員会規則 No. 519/2014¹²付録 II で設定されている性能基準に適合しています。ただし、予想される通り、内部標準法によって真度と精度が向上していることが分かりました（すべてのケースにおいて RSD_r ≤9%）。

再現性試験を通して、目的のマイコトキシンの保持時間（RT）が分析カラムのボイドボリュームの 2 倍以上であるガウス型クロマトグラフィーピークが得られました（図 3）。RT の偏差は許容しきい値の ± 0.05 分以内であることが分かりました。内部標準化に使用した ¹³C 同位体標識されたマイコトキシン類縁物質の RT およびピーク形状は、目的化合物のものと完全に一致しています。未知サンプルのイオン比は、同じシーケンス内の測定での検量線用標準試料の平均から計算したイオン比の ± 30% 以内でした。

この外部標準化によるデータは、マイコトキシン分析で以前に報告された不定のマトリックス効果という課題が重要であることを示しています。この例では、30% を超える程度のニバレノールのシグナル抑制から、1000% を超えるオクラトキシン A のシグナル増強まで、広範囲のマトリックス効果が見られました。この発見は、同位体標識された内部標準の使用の妥当性を明確に示しており、定量の正確度が向上するとともに、様々なマトリックスの影響が打ち消されるため、溶媒標準を使用して作成した検量線の使用が可能になります。

分析コストを低減するため、内部標準混合液を最終抽出液に、直接 LC バイアル内で添加する（つまり、希釈した抽出液 10 μL ～ 400 μL　を添加すると、内部標準溶液の消費が 1/5 に低減されます）ことを選ぶことができます。このようにして、サンプル前処理プロセス全体をスケ－ルアップすることも可能です。例えば、より多くのサンプルを秤量し、抽出溶液の体積を上げ、サンプル抽出溶媒とサンプルの重量比を 4 に維持します。プロセスの最後に IS を添加することの欠点は、IS によって分析種の損失は補償されないため、分析法性能の低下が発生することです。

内部標準が利用できない場合、信頼性の高い定量を達成するために、該当するマトリックスマッチド検量線を作成することもできます。ただし、特に多種多様な商品を扱う場合は、真の「ブランク」の標準物質が常に容易に入手できるとは限りません。

バリデーション試験に使用した市販の小麦粉サンプルには、ラベルの説明の中にビタミン（ナイアシンおよびチアミン）や炭酸カルシウムなどの他の添加物が含まれています。これらの添加剤が存在するにもかかわらず、表 2 に示すように、外部標準または内部標準のいずれを用いて計算しても、すべての対象マイコトキシンについて優れた選択性と直線性（直線範囲が 100 倍以上）が達成されました。

他のマトリックスへの分析法の拡張

小麦粉に加えて、オートミール（粉砕オート麦）、および様々な（添加剤に穀粉リン酸一カルシウム、重炭酸ナトリウム、キサンタンガムを含む米、ジャガイモ、タピオカ、トウモロコシ、ソバなど）のグルテンフリー混合物にこの分析法を応用しました。すべてのサンプルは地元の市場から購入し、分析前にスクリーニングしました。一部のサンプルでは、微量の T-2 トキシンとデオキシニバレノールが検出されましたが、許容範囲を十分に下回っていました。各サンプルに、小麦粉で計算した LOQ 濃度の 12 種のマイコトキシンの混合標準溶液を n=3 でスパイクしました。抽出前に内部標準（50 µL）を添加し、実験方法セクションで説明した分析手順に従ってサンプルを分析しました。

すべての分析化合物の LOQ 濃度において、1 つ目のマトリックス（小麦）で得られた回収率と同等の回収率が他の穀粉でも認められました（S/N 比は > 10）。これらの結果は、多様な内容物や添加剤が存在する場合でも、分析の選択性があることを裏付けています。

• Xevo TQ-XS 分析法は、小麦、オート麦、トウモロコシ、米、ソバがベースの食品などの乾燥穀物製品中の、EU が規制しているマイコトキシンの定量分析において、「目的に適合している」と考えられます。
• Xevo TQ-XS の優れた感度と MRM 取り込みモードの選択性により、サンプル前処理手順が大幅に簡素化され、分析時間と試薬消費量が低減しました。
• 分析ワークフローに 13C 標識内部標準を組み込むと、分析法の性能が向上するため、マイコトキシン分析に影響するマトリックス効果と、サンプル前処理中の分析種の不可避なロスの両方を補正するための効率的なアプローチとして推奨されます。内部標準化により、マトリックスマッチド検量線を使用せずに、溶媒検量線で正確な定量を行うことができます。内部標準の添加は、それぞれの特定の分析要件に応じて、抽出前または抽出後に行うことができます。
• さらに、内部標準を使用することで、この分析法をより多様な商品（乾燥香辛料など）に移行できる可能性があることが分かりました。

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9. B. Magnusson and U. Örnemark (eds.)Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, (2nd ed.2014).ISBN 978-91-87461-59-0.
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