パススルー SPE および UPLC-MS/MS を用いたシリアル、ナッツ、イチジク、および動物飼料中の規制対象および新規マイコトキシンの測定

マイコトキシンは、収穫前および収穫後の汚染メカニズムを介してさまざまな食品中に自然に生成される可能性があり、世界中で規制されています。ここでは、シリアルベースの製品、ピーナッツ、木の実、乾燥イチジクおよび動物用飼料の LC-MS/MS 分析の前に、迅速かつ簡単なパススルー SPE クリーンアップを使用した 31 種の規制対象および新規マイコトキシンのマルチトキシン分析法について説明します。

この分析法は、回収率を最大化し、より使いやすいように開発されました。分析法の性能は、スパイク添加したサンプルを使用してバリデーションし、適宜標準物質を使用して検証しています。

この分析法は、真度および再現性の点で非常に良好な性能を実現し、分析法の LOQ は、アフラトキシンについて 0.25 μg/kg、オクラトキシン A について 1.0 μg/kg と低い値を示しています。

Oasis PRiME HLB SPE クリーンアップは、シンプルで迅速なパススループロトコルを含み、SPE のコンディショニング、平衡化、および洗浄のステップが不要になるため、特に有用です。回収率はすべての分析種について優れており（60 ～ 108% の範囲）、クリーンアッププロトコルの適用範囲が広いことを証明しています。これにより、必要に応じて分析法をより広範囲の化合物に拡張できるため、この点は重要になります。

アプリケーションのメリット

• 複雑で多様なマトリックスに用いることができる単一のマルチマイコトキシン分析法
• パススルー SPE クリーンアップによる主要な共抽出物の除去
• 試験したすべてのマイコトキシンについて規制要件を満たす優れた分析法性能
• より多くの分析種とさまざまな食品・飼料マトリックスに分析法をスケールアップできる可能性あり

マイコトキシンは、ヒトや動物に有毒な真菌由来の二次代謝産物であり、多種多様な食品・飼料に含まれている可能性があります。最も一般的なマイコトキシンは、毒性、出現率、消費データ、並びに経済的・政治的な考慮事項を検討して徹底したリスク評価を行った後、世界の多くの国で規制対象とされています。規制には通常、さまざまな食品・飼料における指定値（最大許容レベルまたはガイダンス値のいずれか）が含まれています。マイコトキシンに適用される規制レベルおよび標準は、世界の地域ごとに異なります¹。 マイコトキシンは毒性が強いため、食品中のマイコトキシンの最大許容レベルは非常に低い値となります。さらに、法規制の枠組みが年々変更されることが予想されており、最大レベルが更新されるとともに、デオキシニバレノールの修飾型、エンニアチン類、アルテルナリア毒素類など、より多くの新規マイコトキシンが今後の法規制に含められると予想されます。

この研究では、3 種類の食品（シリアル、ナッツ、イチジク）および動物用飼料中の 31 種の規制対象および新規マイコトキシンの、シンプルで迅速なサンプル前処理プロトコルおよび LC-MS/MS 分析法の性能について説明します。Oasis PRiME HLB はパススルー固相抽出（SPE）カートリッジで、主要な干渉物の除去に適用され、分析法の頑健性が向上しています²。 親水性-親油性バランスコポリマー（HLB）は、溶媒和、平衡化、またはコンディショニングのステップを必要としないため、時間と溶媒にかかる費用を節約できます。

サンプルの説明および前処理

小麦粉、ピーナッツ、イチジク、動物用飼料（ペット用飼料の混合物）は最寄りの市場で購入しました。各食料品約 200 g を粉砕し、分析ミル（IKA）を用いて均質化してから抽出しました。トウモロコシ粉、ヘーゼルナッツ（水/ナッツスラリー）、乾燥イチジク（水/フルーツスラリー）、動物用飼料（牛）などの標準品は、Fera Science Ltd（FAPAS）から購入しました。 

サンプル抽出およびクリーンアップ

サンプル前処理プロトコルはすべてのマトリックスに対して一貫しており、図 1 に示されています。

均質化した代表的なサンプルの一部（5 g）を 50 mL のプラスチック遠心分離チューブに入れました。サンプルを、0.5% 酢酸と 0.2% ギ酸（v/v）を含む 20 mL の 80：20 MeCN：H₂O で抽出し、10 分間ボルテックス混合しました。> 5000 g で遠心分離した後、上清 0.4 mL を Oasis PRiME HLB カートリッジ（3 cc、150 mg、製品番号 186008717）にロードし、カートリッジベッドを乾燥させて（カートリッジに 3 mL の空気を送り込んで）廃棄しました。上清 1.2 mL をロードし、回収しました。次に、精製した抽出物を、LC-MS/MS 分析用の LC バイアルに直接入れて水で 1：5 に希釈し（200 µL の精製抽出物を 800 µL の H₂O と混合）、全体の希釈係数が 20 になるようにしました。希釈後、抽出物を内径 13 mm の 1.2 µm ガラス繊維シリンジフィルターでろ過しました。マトリックスマッチ標準を定量に使用しました。 

分析法のバリデーション

分析法の真度（回収率を使用）と再現性のバリデーションを行うため、小麦粉、ピーナッツ、イチジク、および動物用飼料サンプルに、3 濃度レベルの 31 種のマイコトキシンの混合物を 3 回繰り返し添加しました（濃度は表 4、5、6、7 に示しています）。次に、前のセクションで説明したように、ブランク試料およびスパイクしたサンプルを抽出して、分析しました。Eurachem ガイドライン³ によると、この分析法の性能は、一部の FAPAS 標準物質（トウモロコシ粉、ヘーゼルナッツ、干しイチジク、動物用飼料）を 6 回繰り返し分析することによっても検証されています。

クロマトグラフィー

クロマトグラフィー性能は、SANTE/12089/2016 のガイドラインと一致していました⁴。 最初に溶出する化合物（ニバレノール）は、保持時間 2.38 分を示し、その結果、カラムのボイドボリューム（V_d）（V_d 約 0.55 分）に対応する保持時間より 2 倍長くなりました。31 種のマイコトキシンを添加した小麦抽出物の代表的なクロマトグラムを図 2 に示します。サンプル抽出物中の分析種の保持時間は、SANTE ガイドラインに従って、許容誤差 ±0.05 分で同じシーケンスで測定したキャリブレーション標準の平均の保持時間に対応していました。RT の再現性は、各シーケンス内で ±0.03 分を超えていました。

化合物のクリティカルペアは次のとおりです。

-      デオキシニバレノール（DON）およびデオキシニバレノール-3-グルコシド（DON-3-Glu）：DON-3-Glu がイオン源でグリコシル基を失うため、これらの化合物は同じ MRM トランジション を有し、[DON+H]⁺ としてモニタリングされます。この分析法により、これらの化合物のベースライン分離が達成されました。

-      3-アセチル-デオキシニバレノール（3-Ac-DON）および 15-アセチル-デオキシニバレノール（15-Ac-DON）：これらの異性体は通常、逆相 LC 次元で部分的に共溶出するため、3-Ac-DON および 15-Ac-DON の合計として通常モニタリングおよび定量されます。これらの化合物は、ACQUITY UPLC HSS T3 カラム（2.1 × 150 mm、1.8 µm、製品番号186003540）を使用して、または ACQUITY UPLC HSS PFP カラム（2.1 × 100 mm、1.8 µm、製品番号 186005967）を使用して分離することができます。アセチル-DON 異性体の分離の詳細については、ウォーターズにお問い合わせください。

直線性、同定および定量限界

分析法の直線性が、試験した濃度範囲にわたって確認されました。検量線の決定係数（R²）は > 0.9900 で、残差は ±20% 未満でした。試験したすべてのサンプルのイオン比は、同じシーケンスのキャリブレーション標準で計算された平均イオン比に対して ±30% 以内でした。表 3 に、溶媒標準品（LOQ レベルでシグナル対ノイズ比 ≥ 10）で計算した装置の定量限界（i-LOQ）を示します。表 4、5、6、7 に、分析法の LOQ（m-LOQ）³ および小麦粉、ピーナッツ、イチジク、動物用飼料のそれぞれの直線性範囲を示します。この分析法の直線性の範囲により、試験した食品の通常の規制レベルでのマイコトキシンの測定が可能になりました。

真度と再現性

試験した全食料品において、回収率は 60% ～ 108%、再現性条件下での相対標準偏差（%RSD_r）は 11% 未満で、規制要件の推奨値⁵ に準拠しています（表 4、5、6、7 を参照）。平均回収率も図 3、4、5、6 に示しています。

真度と再現性はいずれも、独立の標準物質を使用して評価しました。トウモロコシ粉、ヘーゼルナッツ/水スラリー、乾燥イチジク/水スラリー、および動物用飼料の標準物質の計算濃度値は ±2|z|- スコアの間に十分収まっていました。真度は 71 ～ 99% の範囲で、再現性（%RSD_r 、n = 6）は 0.5 ～ 7% の範囲でした（表 8、9、10、11 を参照）。

アフラトキシン類、オクラトキシン A、フモニシン類、ゼアラレノン、A 型および B 型トリコテセン類、エンニアチン類、ビューベリシン、ステリグマトシスチン、シトリニン、アルテルナリア毒素など 11 種類の規制対象マイコトキシンと 20 種類の新規マイコトキシンのためのマルチマイコトキシン分析法の開発とバリデーションに成功しました。この分析法の性能は、欧州規則 No 401/2006 および SANTE ガイドラインで設定された基準を満たしています。シンプルで迅速なパススルー SPE クリーンアップを取り入れて、主要な干渉物を効果的に除去できるため、分析法の頑健性が向上します。

この分析法は優れた真度と再現性を示しており、このことは、既知の濃度のマイコトキシンを含む独立した標準物質を使用して検証されました。この分析法は、シリアルを代表する小麦とトウモロコシおよび高デンプン含量の乾燥食品、グラウンドナッツ・木の実を代表するピーナッツとヘーゼルナッツおよび高脂質含有食品、フルーツや高極性食品を代表するイチジク、動物用飼料など、幅広い食品に適用できます。

最後に、Oasis PRiME HLB クリーンアップが非常に幅広い適用性と汎用性を有するため、この分析法の分析範囲は将来的に拡張される可能性があります。

1. Agriopoulou S., Stamatelopoulou E., Varzakas T. (2020).Advances in Occurrence, Importance, and Mycotoxin Control Strategies: Prevention and Detoxification in Foods.Foods 9(2):137.https://doi.org/10.3390/foods9020137.
2. Oasis Cartridges and 96-Well Plates – Care and use Manual.Waters Corp. (p/n: 715001391).
3. Magnusson B. and Örnemark U. (eds.)Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, (2nd ed.2014).ISBN 978-91-87461-59-0.
4. SANTE/12089/2016.Guidance Document on Identification of Mycotoxins in Food and Feed.Implemented by 01/01/2017.
5. Commission Regulation No 401/2006 of 23 February 2006 Laying Down the Methods of Sampling and Analysis for the Official Control of the Levels of Mycotoxins in Foodstuffs.

略語リスト

AFB₁ = アフラトキシン B₁

AFB₂ = アフラトキシン B₂

AFG₁ = アフラトキシン G₁

AFG₂ = アフラトキシン G₂

FB₁ = フモニシン B₁

FB₂ = フモニシン B₂

FB₃ = フモニシン B₃

OTA = オクラトキシン A

ZEA = ゼアラレノン

DON = デオキシニバレノール

DON-3-Glu = デオキシニバレノール-3-グルコシド

NIV = ニバレノール

HT-2 = HT-2 トキシン

T-2 = T-2 トキシン

3-Ac-DON = 3-アセチル-デオキシニバレノール

15-Ac-DON = 15-アセチル-デオキシニバレノール

DAS = ジアセトキシシルペノール

NEO = ネオソラニオール

デエポオキシ-DON = デエポオキシ-デオキシニバレノール

FUS-X = フザレノン X

AOH-Me-Ether = アルテルナリオール-メチルエーテル