Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムを装着した ACQUITY Premier システムを用いた、ペントースリン酸経路と解糖系の代謝物、およびエネルギー代謝物の分離

従来の LC システムおよびカラムでは、リン酸化代謝物の分析は、金属表面との相互作用により困難になります。ここでは、血漿および組織抽出物中の 27 種のペントースリン酸経路と解糖系の代謝物、およびエネルギー代謝物のターゲット UPLC-MS/MS 分析法について説明します。この分析法では、ACQUITY Premier システムおよび Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムで採用されている MaxPeak High Performance Surfaces テクノロジーの利点を活かして、代謝物の金属表面との相互作用を低減しています。また、移動相に pH 9 の重炭酸アンモニウムバッファーを使用した場合にピーク幅、ピーク対称性、および感度が最良になったことから、高 pH 移動相に対するカラムの安定性も重要です。得られた結果からは、高効率の UPLC の圧力に耐えられる 1.7 μm Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムにより、このような困難な分析種について優れた分離が得られることが実証されています。

アプリケーションのメリット

• ターゲット UPLC-MS/MS 分析法で、27 種類の困難な代謝物についてシャープで対称的なピークを実現
• 塩基性条件で安定性の高い Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムで、最適な pH 9 のバッファーが使用できるように
• MaxPeak High Performance Surfaces テクノロジーを採用した UPLC システムおよびカラムにより、優れたピーク幅とピーク対称性、および感度を実現

中枢炭素代謝は、複数の酵素に媒介される経路で構成され、これらが協調的に働いて、細胞の増殖および恒常性に必要なエネルギー、前駆体、および補因子の還元が行われています。中枢炭素代謝の中でも、解糖系とペントースリン酸経路の 2 つが重要です。解糖系は、酸素が多い条件下でグルコースをピルビン酸に変換し、酸素が少ない条件下で更に乳酸に変換する一連の反応で構成されています。これらの代謝物は、トリカルボン酸（TCA）回路に入ります。このような反応により ATP が生じ、NADH が NAD+ に酸化されます。ペントースリン酸経路は、解糖系の代わりに、グルコースを最終的にリボース 5-リン酸および NADPH に変換します。リボース 5-リン酸は、更に反応して DNA や RNA の構成要素であるリボース糖になります¹。 疾患による中枢炭素代謝物の相対濃度の攪乱について、その根底にあるメカニズムを理解するための研究が行われています²。

ペントースリン酸経路および解糖系の成分の分析では、ほとんどの成分がリン酸基を含むため極性が高いという特性を持ち、多くの異性体が存在するという課題に直面しています。代謝物にリン酸基が存在すると、分析システム中でこれらの分析種が金属表面に吸着する原因になります。そのため、金属への吸着によってピーク形状が悪くなり、ばらつきが大きくなり、感度が低下するため、測定の信頼性が下がります。

双性イオン HILIC カラムである Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムを使用して、ペントースリン酸経路と解糖系の代謝物、およびエネルギー代謝物を分析する分析法を紹介します。このカラムには、エチレン架橋型ハイブリッド（BEH）粒子上のスルホベタイン固定相が含まれています³。 この材質が MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）カラムハードウェアに充塡されており、金属に吸着しやすい化合物の金属表面との相互作用が低減します⁴。 このカラムを、MaxPeak HPS テクノロジーを採用した ACQUITY Premier システムおよび Xevo TQ-S micro タンデム四重極質量分析計で使用しました。

移動相の調製

調製の再現性を確保するため、最適化した移動相を 3 日ごとに重量測定法で調製しました。上皿天びんで重炭酸アンモニウム（Sigma 09830） 2.96 g を秤量し、水を加えて 240 g にして 150 mM 重炭酸アンモニウム pH 9.00 のストック溶液を調製しました。次にこの溶液に、28% 水酸化アンモニウム水（Sigma 338818）を加えて pH 9.00（+/- 0.02）に調整し、天びんに戻して 250 g になるように正確に計量しました。このバッファー濃縮液 100 g を 2 本の LDPE 移動相のボトルに加えました。900 g の水を秤量して 1 本のボトルに加えて移動相 A を作製し、707.6 g（900 mL）のアセトニトリル（ACN）を計量して 2 本目のボトルに加えて移動相 B を作製しました。これらの移動相にしっかりとキャップし、20 分間超音波処理してから使用しました。

pH スクリーニング用の移動相も同様の方法で作製しましたが、移動相 A と B の最終的な比率は容積で測定しました。簡単に説明すると、0.976 g の酢酸アンモニウム（Sigma 431311）を秤量し、水を加えて約 100 g にしました。酢酸（Sigma 338826）または 28% 水酸化アンモニウムのいずれかを添加して pH を調整した後、溶液を天びんに戻して重量 125 g を正確に計量し、100 mM 溶液にしました。この溶液 50mL を 2 本の移動相ボトルに加えました。1 本のボトルに 450 mL の水を加えて移動相 A を作製し、もう 1 本のボトルに 450 mL のアセトニトリルを加えて移動相 B を作製しました。しっかりとキャップをして 20 分間超音波処理しました。

ストック溶液の調製

高純度の分析種の標準品は Sigma Aldrich から入手しました。グリセルアルデヒド 3-リン酸は 10.7 mg/mL 水溶液、その他はすべて固体として購入しました。ストック溶液は、20 mM 遊離酸の 50% ACN/50% H₂O 溶液を個別に作製しました。次に、これらを合わせて 3 つの等濃度（1 mM）混合物の 50% ACN/50% H₂O 溶液にし、作業用ストック溶液としました。安定同位体標識内部標準溶液（Cambridge Isotope Laboratories、Sigma Aldrich）はそれぞれ、50% ACN/50% H₂O 中に遊離酸濃度 1 mM で作製しました。100 μM の乳酸¹³C と、それぞれ 10 μM のグルコース 6-リン酸-13C、AMP-¹³C¹⁵N、ADP-¹⁵N、ATP-¹³C、GMP-¹³C¹⁵N、および GTP-¹³C を含む 5 倍濃度の作業用内部混合標準液は、50% ACN/50% H₂O 中に作製しました。すべてのストック溶液を -20 ℃ で保管しました。

検量線用の標準液は、50% ACN/50% H₂O 中に、作業用ストック溶液からの連続希釈により調製し、250、125、50、25、12.5、5、2.5、1.25、0.50、0.250、0.125、0.050 μM の標準ストック溶液を作製しました。各標準 5 μL および内部混合標準液 5 μL を、シラン処理済みバイアル中の 50% ACN/50% H₂O 15 μL に加えました。これは 25 μL 中でそれぞれ 50、25、10、5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01 μM のキャリブレーション溶液になります。次に、50% ACN/50% H₂O 75 μL を加えて、最終容量を 100 μL にしました。したがって、検量線の最終濃度は 12.5、6.25、2.5、1.25、0.625、0.25、0.125、0.0625、0.025、0.0125、0.00625、0.0025 μM になります。

肝臓および脳からの抽出

サンプル前処理は、以前説明した方法⁵ に基づき、変更を加えて行いました。メスの Sprague Dawley ラットの肝臓およびオスの Sprague Dawley ラットの脳は BioIVT（米国ニューヨーク州ウエストバリー）から入手しました。25 mL の肝臓/脳を 2 mL の Precellys 組織均質化チューブ（製品番号 10409）に加え、続いて 750 μL の 80% MeOH/20% H₂O（氷冷）を加えました。サンプルは、5,800 rpm で 3 × 15 秒間、サイクル間に 30 秒の休止があるプログラムを使用して Precellys Evolution で均質化しました。ホモジネートを新しい 1.5 mL 微量遠心チューブにピペッティングし、これを 20 ℃ で 60 分間放置しました。サンプルを 18,407 x g、4 ℃ で 10 分間遠心分離しました。上清を 1.5 mL の微量遠心チューブに移し、TurboVap を使用して室温で、1 L/分で 100 分間、2.5 L/分で 30 分間乾燥させました。サンプルを 50 μL の 50% ACN/50% H₂O に再溶解し、簡単にボルテックス混合して 4 ℃ で 10 分間放置した後、18,407 x g、4 ℃ で 10 分間遠心分離しました。サンプルは、トータルリカバリーシラン処理済みバイアルにピペッティングし、すぐに分析しました。

血漿の抽出

プールした性別別の Sprague Dawley K2EDTA 血漿は、BioIVT（米国ニューヨーク州ウエストバリー）から購入しました。25 μL の血漿を 1.5 mL の微量遠心チューブに加えました。次に、125 μL の 80% MeOH/20% H₂O（氷冷）を加えました。1 分間ボルテックス混合し、カバーをかけて、室温で 20 分間、シェイカーで 250 rpm で振とうしました。次に、このサンプルを -20 ℃ のフリーザーに 60 分間放置しました。サンプルを 18,407 × g、4 ℃ で 10 分間遠心分離しました。上清は、1.5 mL の微量遠心チューブに移し、TurboVap を使用して室温で、1 L/分で 100 分間、2.5 L/分で 30 分間乾燥させました。サンプルを 50 μL の 50% ACN/50% H₂O に再溶解し、簡単にボルテックス混合して 4 ℃ で 10 分間放置した後、18,407 x g、4 ℃ で 10 分間遠心分離しました。サンプルは、トータルリカバリーシラン処理済みバイアルにピペッティングし、すぐに分析しました。

以前の研究において、約 pH 9 の酢酸アンモニウムまたは重炭酸アンモニウムバッファーを含む移動相を使用したときに、リン酸化代謝物について最良のピーク幅、対称性、および感度が得られたことが報告されています^6-9。 ただし、この pH で安定な HILIC カラムはほとんどなく、主な例外として有機ポリマーまたはエチレン架橋型ハイブリッド（BEH）粒子をベースにしたものが挙げられます。ポリマー粒子を含むカラムは、圧力範囲が非常に限られており、ハイブリッド粒子を充塡したカラムと比べて効率が比較的低くなっています。Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムは、pH 10 での安定性と高効率を兼ね備えていることから³、このアプリケーションに最適です。更に、このカラムでは、カラムハードウェアに MaxPeak High Performance Surfaces（HPS）を使用しているため、分析種と金属表面の間の相互作用が低減し、金属に吸着しやすい化合物のピーク形状、ピーク面積、ピーク面積の再現性が向上しています^4,10,11。

3 種類のバッファーの pH 値について評価し、ピーク幅、対称性、および感度に対する影響を判定しました。使用した溶液にはすべて 10 mM 酢酸アンモニウムが含まれており、pH を 5.0、6.8、または 9.0 に調整しています。4 種類の分析種についての結果を図 1 に示します。3-ホスホグリセリン酸（3PG）、グアノシン 3-リン酸（GTP）、アデノシン 3-リン酸（ATP）については、pH 9.0 のバッファーを使用して最良の結果が得られました。この結果は、異なるカラムを使用した以前の試験の結果と一致しています^6–9。対照的に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）では、3 種類のバッファーすべてで幅の狭い対称性のピークが見られました。また、バッファーの選択と濃度がピーク形状と分析種の保持に及ぼす影響を調べるために、pH 9.0 の重炭酸アンモニウムについても調査しました。重炭酸アンモニウム（pH 9.0）を使用すると、保持は低下したものの、大半の化合物についてピーク形状が改善しました（図 2）。重炭酸アンモニウム（pH 9.0）を使用すると、リボース 5-リン酸（5P）の同重体であるリブロース 5P/キシルロース 5Pからの分離が改善し、3PG のピークが大幅にシャープになることが分かりました。最後に、ピーク形状と保持に対するバッファー濃度の影響を調べました。移動相 A と B の両方に pH 9.0（5、10、15、20 mM）の重炭酸アンモニウムバッファーを用いて分離を行いました。図 3 に、この試験の結果の例として 2PG と 3PG の分離を示します。バッファー濃度を上げると、分析種の保持時間が長くなることが分かります。実際、この現象はこの試験で用いたすべての分析種で見られました。15 mM 重炭酸アンモニウム（pH 9.0）バッファーにより、3PG および他の分析種に最適なピーク形状が得られたので、これを最終的な分析法に用いました。

各分析種を質量分析計に注入することで MS 条件を最適化しました。最適なパラメーターを表 1 に示します。50：50 アセトニトリル/水に溶解した 27 種の分析種の代表的な分離を図 4 に示します。2.1 × 100 mm、1.7 μm Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムを流速 0.5 mL/分で使用しました。ポジティブおよびネガティブのイオンエレクトロスプレー（ES）イオン化を使用して検出されたクロマトグラムを別々に示します。ほぼすべての分析種について、シャープで対称性のあるピークが見られました。同重体ペアである 5P/リボース-5P および 2PG/3PG が十分に分離されました。安定同位体標識内部標準に対するピーク面積の比を使用して、27 種類の分析種すべてについて検量線を作成しました。相関係数は、グリセルアルデヒド-3-リン酸の 0.9904 から、リブロース 5P/キシルロース 5P および ADP の 0.9996 までの範囲でした（表 2 参照）。定量下限（LLOQ）は 0.0063 ～ 1.25 μM の範囲でした。

この分析法を、ラット血漿、ラット肝臓、ラット脳の抽出物中の 27 種の分析種のターゲット分析に使用しました。代表的なクロマトグラムを図 5 に示しました。これらの組織抽出物中には、溶媒中に調製した標準で見られたようなシャープで対称性のあるピークも見られました。血漿サンプル中に、高濃度のホスホエノールピルビン酸（PEP）が、3PG、ADP、GMP、フルクトース-6-リン酸（F6P）、グルコース-6-リン酸（G6P）とともに検出されました。後者の 3 種類の代謝物は、肝臓と脳の組織サンプルでも見られました。更に、肝臓抽出物には高濃度のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）が認められ、脳抽出物には高濃度のアセチルコエンザイム A（アセチル CoA）が認められました。 

血漿および組織抽出物中の 27 種のペントースリン酸経路と解糖系の代謝物、およびエネルギー代謝物のターゲット分析のための高感度 UPLC-MS/MS 分析法を開発しました。ACQUITY Premier システムと Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムを使用することで、これらの困難な分析種について、シャープで対称性のあるピークが得られました。pH 9.0 の重炭酸アンモニウムバッファーを使用した場合、多くの代謝物について最良のピーク幅、ピークの対称性、および感度が得られたことから、この分析法には、塩基性移動相に対する BEH Z-HILIC カラムの安定性が不可欠でした。この結果からは、ACQUITY Premier システムと Atlantis Premier BEH Z-HILIC カラムが、特に金属表面と相互作用する代謝物の極性メタボロミクスアッセイに有用であることが示唆されます。

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