アドバンスドポリマークロマトグラフィーを用いたポリヒドロキシアルカノエートベースのバイオプラスチック原料の多次元特性解析

ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）は、発酵によって生成される生分解性ポリマーの 1 種 であり、化石燃料由来の使い捨てプラスチックに取って代わる可能性があります。PHA は通常、異なる PHA ごとに、生化学的原料、使用する微生物、生体反応条件に基づいて組成が大きく異なる共重合体です。ただし、この共重合体を構成する最も一般的な成分はポリ-3-ヒドロキシ酪酸（PHB）とポリ-3-ヒドロキシ吉草酸（PHV）の 2 つで、PHB が主成分です。これらの成分の比率により、熱的特性、機械的特性、結晶性などの材料の特性が支配されます。

この実現可能性試験では、1 次元 SEC 分析でさまざまな PHB 比から PHV 比までの挙動の違いを解明するには多くの場合不十分であるため、アドバンストポリマークロマトグラフィー™ とエバポレイト光散乱検出（ELSD）を用いた 2 次元分析を使用して、化学組成の分布のより多くの洞察を取得しました。

アプリケーションのメリット

• APC の溶媒適合性により、1 次元目と 2 次元目での、順相クロマトグラフィーおよび通常の非極性溶媒の使用が可能になります
• WinGPC ソフトウェアによる、等高線プロットおよび分子量の簡単なデータ取り込みおよびデータ解析
• 1 回の実験で組成とサイズに基づく分離によって共重合体を分離

プラスチックは、特に包装での幅広い用途により、日常生活に欠かせない商品になっています。プラスチックは、化石燃料由来のプラスチックとバイオ原料由来のプラスチックの 2 つの主要クラスに分けることができます。現在、ほとんどのプラスチックは化石燃料由来ですが、環境保護に配慮する考え方が着実に高まっており、バイオ原料プラスチックへの製造のシフトが進んでいます。バイオプラスチックは再生可能な原料に由来しているため、より持続可能であり、それが魅力です。さらに、すべてのバイオプラスチックに当てはまるわけではありませんが、通常、化石燃料由来の相当品よりはるかに生分解可能です。バイオ由来/生分解性プラスチックの一例は、ポリヒドロキシアルカノエート（PHA）です。これについては、一般に使用されているポリオレフィン系の PE や PP、ならびに PET や PS に取って代わる兆しが見えています。これらは、さまざまな種類の炭素原料の発酵により、さまざまなバクテリアによって合成される生分解性の直鎖状（コ）ポリエステルです。PHA には、高い生分解性および生体適合性があるため、環境に優しい特性を持っています。PHA は現在、いくつか例を挙げると、食品包装、飲料用ボトルのコーティングなど、幅広い用途で使用されています。

ポリ-3-ヒドロキシ酪酸（PHB）およびその共重合体は、依然として最もよく使用されている PHA です。PHB は結晶性ポリマーで、硬くてもろい物理特性を示します。ポリ-3-ヒドロキシ吉草酸（PHV）を PHB の骨格に組み込むことで、ポリマーの引張強度と耐衝撃性の両方が増加し、結果として得られる共重合体の融点が純粋な PHB と比較して低下するなど、他の特性が変化し、加工可能性が向上します。ポリ（3-PHBV）コポリエステルは、コモノマー組成と分子量が広く分布するランダム（コ）ポリエステルの混合物であることが示されています。市販の PHA に同様の化学組成のばらつきがある可能性があり、その化学組成のばらつきは商業用途で特に問題があるため、一般にその特性解析は非常に重要です。従来の特性解析では、部分分解後に GC-MS が使用されます^1,2。 ただし、これによっては、分子量の広がりや、元のポリマーサンプルに存在する可能性がある共重合体組成のばらつきや分布に関する情報は得られません。サイズ別の分離それ自体では、流体力学的体積が同じで化学組成が異なる成分が分離されない可能性があります。一方、純粋な化学的分離では、組成分布に関してより詳細な情報が得られますが、分子量分布の間でコユニットがどのように分布しているかを識別できません。2 次元（2D）分析は、この相互依存関係を解決するための選択肢です。

この実現可能性試験では、両次元のメインの溶媒成分としてクロロホルムを用いた 2 次元 APC 分析法を用いて、PHV と PHB の比が異なるいくつかのポリ（3-PHBV）ポリエステルを分析しました。ただし、分布の違いを把握するために、同様のガラス転移温度（T_g、データは示されていません）を使用しました。 

ポリ（3-PHBV）サンプルをエタノールで安定化したクロロホルムに溶解して 10 mg/mL 溶液を作成し、一晩低速で回転ドラムにかけました。0.22 µm PTFE フィルターでろ過する前に、サンプル溶液を 3,900 rpmで 70 分間遠心分離し、特に麦わらからの不溶性物質を除去しました。得られたろ液体を 1:4 に希釈して 2 mg/mL のサンプル溶液を作製し、注入用に 2 mL のサンプルバイアルに入れました。

2D 分析を行う前に、BEH XT 450 Å カラムを用いて、サイズ別の分離をクロロホルム中で行いました。図 1 のクロマトグラムでは、各サンプルにピーク 1 本のみが示されています。サンプルが少なくとも 2 成分で構成されていると仮定すると、共溶出が起きていると推測できます。サイズ別の分離では、3 つのポリ（3-PHBV）サンプル間に差異はありません。 

後続するステップとして化学組成による分離を、SunFire™ シリカカラムを用い、クロロホルムからクロロホルム/テトラヒドロフラン混合液へのグラジエントを用いて行いました。図 2 に示されているように、試行目的の急勾配のグラジエントでの後続の分離では、サンプル 1 以外のすべてのサンプルで 2 本のピークが検出されています。サンプル 1 の単一のピークは、サンプル 2 および 3 の最初のピークよりも早く溶出しています。約 8 分での 2 番目のピークは、サンプル 2 とサンプル 3 にのみ存在します。サンプル 1 とサンプル 2 および 3 には違いがあると思われますが、サンプル 2 と 3 の違いについての情報は得られていません。この試行では、個々の手法のいずれからも、単独では十分な情報は得られませんでした。異なる注入量やサンプル濃度によって、異なる ELSD シグナル強度が発生します。

個々の化学組成別の分離およびサイズ別の分離の主要なパラメーターが、WinGPC ソフトウェアでの 2D セットアップに必要な実行条件の手動計算に役立ちました。

• 2 次元目の実行時間とループ容量から、完全な 2D 測定の 1 次元目の流速が得られます。
• 2 次元目で分離されるトランスファーフラクションの量は、最初のピークが溶出するまでの 1 次元目の注入量とループ容量から決定されます。
• 上記の量を 1 次元目の流速で割った値が、両方の手法をタンデムで実行する完全な 2D 分析の合計実行時間になります。

これらの値は、WinGPC での簡単なガイド付き 2D バルブセットアップに必要です。まず、装置メソッドが読み込まれます（図 3）。

上記で概説されている計算済みパラメーターを入力して、プロンプトの指示に従って「バルブに設定を適用し」、保存されたシーケンスを読み込むと、2D 分析が開始されます（図 4）。サンプルシーケンスのセットアップは、サンプルウィザードで行うこともできます。

3 つのポリ（3-PHBV）サンプルすべてについて得られた等高線プロットが、図 5 ～ 7 に示されています。X 軸の 2 次元目の分析（サイズ別の分離）の溶出量が、Y 軸の 1 次元目の分析（グラジエント分離）の溶出時間に対してプロットされています。個々のクロマトグラムは一見似ていますが、等高線プロットはすべて異なっているように見えます。図 5 のサンプル 1 の等高線プロットでは、図 1 および図 2 の単一のピーク（黒色のトレース）ではなく、3 つの集団が示されています。サイズ別の分離の実行で最初に共溶出した X 軸での溶出量 1.1 mL と 1.2 mL の間の 2 つの集団（図 5）は、1 次元目のグラジエント分析で分離されました。図 5 の溶出量約 1.5 mL にある 3 番目の集団は、溶出時間 0.7 ～ 0.8 分の個々のサイズ別の注入の後部にマスクされています（図 1）。

図 6 にサンプル 2 の等高線プロットが示されています。最初のサイズベースの分離の実行では共溶出が起きましたが（図 1）、これらは 1 次元目のグラジエント分析で分離されており（図 2）、グラジエントクロマトグラフィーで溶出時間 40 分あたりに遅く溶出する集団は、SEC での溶出量が、図 6 の早く溶出する集団と異なっています。このように、2 つの集団は、組成（1 次元目の溶出時間）と分子量（2 次元目の溶出時間）が異なります。これは、SEC やグラジエントのみからは得られない情報です。

図 7 に、麦わらサンプルの等高線プロットが示されています。麦わらの 2D 分離のパターンはサンプル 2 と似ていますが、図 7 の等高線プロットから得られる情報は似ていません。どちらの集団も SEC での溶出量が同じで、分子量はほぼ同じです。一方、サンプル 2 では、SEC での溶出量とそれぞれの分子量が異なる、化学的に異なる 2 つの集団が示されました。このような情報は、SEC のみおよびグラジエントのみの実行からは得られません。

2D-APC-ELSD メソッドを使用した複数のポリ（3-PHBV）サンプルの分析により、1 次元分離では測定できなかったサンプル間の重要な違いが明らかになりました。

個々のサイズベースの分離で起きた共溶出の問題は、サンプル 1 について 1 次元目に化学組成による分離を追加することで、正常に解決されました。サンプル 2 と麦わらの間の微妙な違いでは、サンプル 2 の化学的に異なる成分の分子量が異なっているのに対し、麦わらサンプルでは化学的に異なる成分の分子量がほぼ同じでした。

WinGPC ソフトウェアの機能は、完全な 2D 分析のシステムセットアップの効率化に役立ち、分析者が期限付きの装置で費やす時間が節約されます。

APC 溶媒は、ハロゲン化溶媒および通常の非極性溶媒に適合するため、分析間やアイドリングの間にそれほど強くない溶媒に切り替えずに、連続動作が可能です。 

1. Adamus G. Aliphatic Polyesters for Advanced Technologies – Structural Characterization of Biopolyesters with the Aid of Mass Spectrometry.Macromol.Symp.2006 Jun;239:77–83.
2. de Rijk T, van de Meer P, Eggink G. Biopolymers - Polyesters II Properties and Chemical Synthesis.Ed: Steinbuechel A. Wiley-VCH.2001.