高分子バイオ医薬品の陰イオン交換分析における Gen-Pak™ FAX カラムの特性およびその有用性

タンパク質ベースおよび核酸ベースの医薬品のパイプラインが急成長するにともない、原薬および製剤に含まれる成分の濃度、完全性、相対存在量を確認できるイオン交換分析法の改善が求められています。

Gen-Pak FAX カラムとして知られる弱陰イオン交換体は、さまざまなタンパク質およびオリゴヌクレオチドの分離において、保持力が比較的低く、反応速度効率が高いことがわかっています。これに代わる強陰イオン交換体を用いた比較試験により、Gen-Pak FAX カラムケミストリーの独自性が裏付けられています。Gen-Pak FAX カラムでは固定相の膨張があまり大きくないことが分かっているので、高流速および低塩濃度の移動相がより容易に適用できます。さらに、Gen-Pak FAX カラムの独特の溶出挙動により、新規の分離条件の開発が可能になり、オリゴヌクレオチド不純物の分離において、これまでに類を見ない選択性が得られます。

アプリケーションのメリット

• 低分子オリゴヌクレオチドや中性 pI のタンパク質に対するピークキャパシティの向上
• カラム圧が低いことにより、高流速およびハイスループットでの分析が容易に行える
• 保持力が低く選択性が特徴的であるため、新規の分離に使用できる

バイオポリマー（ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、高分子核酸）は、もともと荷電しているため、イオン交換（IEX）分離に適した基質です。配列、翻訳後修飾、分子の長さ、さまざまな配座異性体やアイソフォームの存在が、全体的な正味の電荷の差と相関している可能性があります。したがって、生体分子を、荷電した固定相との静電相互作用により、効率的に分画できる可能性があります。IEX は通常、マイルドな非変性条件で溶出を行うため、さまざまな種類のバイオ医薬品を精製するための製造プロセスの一環として IEX がしばしば使用されます。

IEX は、表面電荷の差に基づいて微細な分離を行うことができるため、医薬品用タンパク質のチャージバリアントや医薬品用オリゴヌクレオチドの不純物をモニターするための理想的な分析ツールにもなっています^1,2,3,4,5。

市販のほとんどの医薬品用モノクローナル抗体（mAb）は、8 より大きい等電点（pI 値）を有します。このため、陽イオン交換体（CEX）は、mAb のチャージバリアントの分析に通常使用されています⁶。 一方、ナタリズマブなどの IgG4 サブクラスの mAb は、pI が低い傾向があるため、陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィーによる分析が適している可能性があります⁷。 したがって、陰イオン交換体の性能をタンパク質分離について評価することが重要になります。CRISPR テクノロジーの出現により、Cas ヌクレアーゼおよびリボヌクレオタンパク質複合体に対する新たな分析手法の開発が必要になりました。AEX はこれらのタンパク性物質にも役立つ可能性があります。

同様に重要なこととして、AEX カラムは、オリゴヌクレオチドや核酸の分析に役立つ可能性があります。これらの種類の生体分子は、糖リン酸バックボーン中のリン酸基が原因で負に荷電しています（pK_a1 = 2.14）。AEX はすでに、合成 DNA、RNA、天然物、プラスミドの精製および分析に使用されています^8,9,10。 伸長中の鎖にヌクレオチドが追加されるたびに、核酸に負電荷が追加され、これが AEX での保持増大に直接寄与します。したがって理論的には、AEX によって、長さが異なるオリゴヌクレオチドに対する選択性が得られるはずです¹¹。 このように選択性が期待できるにもかかわらず、一部の分析スケールの AEX 分析法では、分析種の回収率が悪く、キャリーオーバー効果が大きいために、頑健性が不足しています。最近、私たちは、AEX 分離を改善するために、新しい分析法における検討事項を提案しました⁵。 主な検討事項の 1 つは、弱 AEX 固定相を強イオン交換体の代わりに使用することです。弱イオン交換体を使用すると、サンプルのロード時における溶質と固定相の官能基の間の結合強度がもともと弱いため、特に移動相 pH を最適に調整できる場合に、回収率が高くなる場合があります⁵。 調査により、固定相の保持力と、高分子核酸の回収率およびキャリーオーバーには相関があることがわかりました。

このアプリケーションノートでは、最新の分析法開発実験において Gen-Pak FAX カラムが最近期待されているため、その特性をレビューすることにしました。1990 年代はじめにウォーターズによって最初に導入された Gen-Pak™ FAX カラムは、2.5 µm の非多孔性ポリマーパーティクルテクノロジーに基づいており、現在でも便利に使用されています。   

今回、Gen-Pak FAX カラムによって得られる分離の 3 つの例、およびその（1）IgG4 mAb、（2）15 ～ 35 mer のオリゴヌクレオチド dT ラダー、（3）アンチセンスオリゴヌクレオチドのモデル混合物を含むバイオポリマーの分析への応用について説明します。

ナタリズマブおよびオリゴヌクレオチドラダーの LC 分析

サンプル前処理
ナタリズマブ（6 mg/mL）は、Tysabri™（ナタリズマブ）（Biogen、マサチューセッツ州ケンブリッジ）の有効期限切れ薬として入手し、水で 1 mg/mL に希釈した後、それ以上の前処理を行わずに注入しました。オリゴ dT ラダーは、MassPREP™ オリゴヌクレオチド標準試料（製品番号：186004135）のバイアルの内容物を 100 µL の水に再溶解して調製しました。

移動相の調製
ナタリズマブおよびオリゴ dT ラダーの分析用に、トリス-（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）および塩化ナトリウム（NaCl）は Sigma-Aldrich（スイス、ブフス）から購入しました。トリスバッファーは 20 mM 溶液として調製し、pH を約 8.0 に調整しました。この 20 mM トリスバッファーを移動相 A として使用しました。移動相 B は、20 mM トリスバッファーに NaCl を溶解したものです（最大 600 mM）。

全般的な検討事項

分析的陰イオン交換では、非多孔性樹脂を使用した場合に最良の性能が得られます。非多孔性粒子は、結合キャパシティが限定されますが、生体分子は拡散性が低く、静電相互作用が強いため、高分離能分析で好まれます。非多孔性粒子は、質量トランスファーに関連するバンドの広がりを最小限に抑えるのに役立ちます。AEX 固定相の分離能の最大の決定要因は、多くの場合、固定相の結合（あるいは電荷を持つリガンドを取り込むために使用される表面の組成）です。

前述したように、ウォーターズは 90 年代はじめにオリゴヌクレオチド専用の GenPak FAX カラムを最初に導入しました。このカラムは、今日の最新の分析法の多くで、十分以上に目的に適合しています。

私たちのチームは、以前の試験において、4.6 × 50 mm カラム型式でさまざまな樹脂を比較しました。Gen-Pak FAX カラムの固定相を、他の 2 種類の市販の SAX 樹脂（1 つは 4 µm の非多孔性粒子ベース、もう 1 つは 3 µm の非多孔性粒子ベース）と並べて試験しました。本質的に同一のグラジエント勾配を維持し、異なる AEX カラムで得られた分離の質を試験することで、比較測定を行いました。   

IgG4 mAb の分析（ナタリズマブ）

カラムをまず、タンパク質サンプルを分離する性能について試験しました。ナタリズマブは AEX モードの分離に適した中性 pI の mAb であるため、これを選択しました。

この試験では、各固定相を、分離能および保持力の特性について調査しました。トリス（pH 8）移動相システムで得られたチャージバリアントのクロマトグラムを図 1 に示します。最初に観察されるのは、2 種類の強 AEX カラムは、弱イオン交換体である Gen-Pak FAX カラムよりも保持力が大幅に強いことです。

この保持力の低さは、アッセイのニーズに応じて利点にも欠点にもなり得ます。IEX 分析法では多くの場合、未だに経験的観察（試行錯誤）を用いて開発が行われています。そのため、ツールボックスに複数のツール（弱 AEX カラムと強 AEX カラムの両方）を入れることが有用です。

図 1 から、Gen-Pak FAX カラムを使用した場合に、メインのアイソフォームのピークが最もシャープになり、（メインピークと右肩のバリアントの間の）分離が最大になることがわかります。ピークバレー比は、弱イオン交換体で p/v = 3.97、強イオン交換体で 2.86 および 2.19 でした。

IEX において興味深い分析法パラメーターとして、カラムによって生成される圧力があります。高分子の IEX において、圧力は、分離効率だけでなく、選択性および全体的な保持力にも影響する可能性があります^13,14。 液体クロマトグラフィーのほとんどのモードにおいて、固定相の多孔質性は移動相組成とは無関係に一定であると想定されます。ただし、塩（または十分なイオン強度）が存在しない場合には、イオン交換の固定相が膨張することがよく知られており、最近では、いわゆる濡れ/脱濡れ過程も見出され、カラムの多孔質性は、使用するクロマトグラフィー条件によって変わることが証明されました^15,16,17,18。 IEX 相の膨張は通常、圧力の上昇（カラム浸透性の低下）および見かけのカラム多孔質性の変化として表れます。そのため、バッファー濃度が 0.02 M 以上の移動相でイオン交換カラムを使用することが一般に推奨されています¹⁹。

各カラムで生じる最大背圧が記録され、図 2 に報告されています。2 種類の SAX カラムの背圧は高く、非常に類似しています。塩濃度の低い移動相が IEX カラムを通過する際は、ほとんどの場合、圧力が高くなります。結合相の浸透性が、この現象の主要な決定要因の 1 つです。結合相の組成および厚さの差が圧力の影響の差と相関しています¹³。 Gen-Pak FAX カラムは浸透性がかなり大きく、それに応じて圧力が低いことに注意してください。したがって、Gen-Pak FAX カラムでは、膨張や加圧についてあまり心配することなく、より低塩濃度の移動相を使用できる可能性があります。また、Gen-Pak FAX カラム固定相を使用することで、高流速でハイスループットの分析法をより簡単に調整できる可能性もあります。

15 ～ 35 mer のオリゴヌクレオチド dT ラダーの分離

同様の実験を行って、15 ～ 35 mer のオリゴヌクレオチド dT ラダー内の一連のクリティカルペアを比較しました。分離の範囲として最初と最後の保持時間を使用して、各セットのピークプロファイルについて、有効ピークキャパシティを算出しました。Gen-Pak FAX カラム粒子を 2 種類の SAX 固定相と再度比較しました（図 3）。Gen-Pak FAX カラムでは、これらの低分子オリゴに対しても保持力が低く、ピークキャパシティ（Pc）値は同等またはより高かったことに注意してください。Gen-Pak FAX カラムでは Pc = 98、2 種類の SAX カラムでは Pc = 97 および 75 でした。動作圧も、Gen-Pak Fax カラムでは、SAX 相と比較してはるかに（ほぼ 3 分の 1）低い値でした。 

アンチセンスオリゴヌクレオチドモデル混合物の分離

最近、Stilianos Roussis および Claus Rentel が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）不純物分析のための新しい分析法を報告しました¹²。 彼らは、新たな種類の選択性が得られ、脱アミノ化不純物の検出が容易になる分離法を求めていました。試験したカラムのうち、特別に考案した移動相条件に適用できると考えられたのは Gen-Pak FAX カラムでした。オリゴヌクレオチドに対する独自の選択性を得るのに最適な溶離液は、75% メタノールで構成された溶離液であることがわかりました。この新規条件では、溶解度の問題により、溶離液の塩濃度に制限がありました。この溶離液では、臭化ナトリウムとグアニジンをいずれも濃度 250 mM で使用しました。Gen-Pak FAX カラムの固定相は保持力が低いため、この分析法の開発が容易になりました。この論文の著者らは、弱 AEX カラム（Gen-Pak FAX カラム）の最も大きな有益な効果は、高有機含量で低塩濃度の移動相での溶出に対する適合性であると結論付けています。これらの新規の AEX 条件により、余計な疎水性、極性/親水性、水素結合による相互作用を回避し、単一のイオン性/静電性の分離メカニズムを最大化することができました。主にイオン性/静電性の差に基づく、ホスホロチオエート（PS）オリゴヌクレオチド不純物の分離性能に向上が認められました。

報告された分離は、固定相の静電電位および分析種のイオン化に対応する pH グラジエント効果のメリットも享受していると言われています。この新規の WAX 分析法により、SAX クロマトグラフィーと比較して、極めて良好な分離が得られました。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの脱アミノ化の程度が、液体クロマトグラフィーによって初めて直接決定されました。

ASO 不純物分析の新たな選択性の例を図 4 に示します。このような分離は、イオン対逆相（IP-RP）クロマトグラフィーでは得られないことに注意してください。したがって、弱 AEX モードと IP-RP モードの両方を、オリゴヌクレオチドの包括的かつ補完的な分析法と見なすことができます。

この短いレビュードキュメントおよびアプリケーションノートでは、弱陰イオン交換 Gen-Pak FAX カラムの利点を効果的に利用した、いくつかの例を紹介しています。さまざまなタンパク質およびオリゴヌクレオチド/核酸の分離において、Gen-Pak FAX カラムは、強 AEX カラムと比較して低い保持力を示します。保持力がこのように低いことで、特に移動相 pH を調整して最適化できる場合には、いくつかの利点が得られる可能性があります。

溶質と固定相の間の相互作用がもともと弱いことに起因して、分離の効率が大幅に向上しています。Gen-Pak FAX カラムでは、ナタリズマブおよび 15 ～ 35 mer のオリゴヌクレオチド dT ラダーについて、他の SAX カラムと比較してより高いピークキャパシティが認められました。別の試験において、このカラムの低い保持力は、高分子核酸（インタクト mRNA）の分析に有用であり、溶質の回収率および分析法の頑健性に向上が見られることがわかっています⁵。

Gen-Pak FAX カラムは浸透性も良好であることがわかりました。浸透性の大幅な向上が見られたことから、Gen-Pak FAX カラムでは、膨張や加圧についてあまり心配することなく、より低塩濃度の移動相を使用できる可能性があります。この高い浸透性により、高流速での動作も可能になり、ハイスループットの分析法を開発できるようになりました。   

最後に、Gen-Pak FAX カラムの保持力が低いことから、高有機含量（最大 75% MeOH）の溶離液組成と NaBr およびグアニジンの組み合わせによって新たな選択性が得られる、新規の種類の AEX 分析法の開発も触発されました。このような条件によって、非特異的相互作用を最小限に抑え、静電相互作用に基づく分離メカニズムを最大化することが提案されています。

Gen-Pak、ACQUITY、MassPREP、UPLC、および Empower は Waters Technologies Corporation の商標です。Tysabri は Biogen MA Inc. の商標です。

1. S. Fekete, A. Beck, J.L. Veuthey, D. Guillarme, Ion-exchange Chromatography for The Characterization of Biopharmaceuticals, J. Pharm.Biomed.Anal.113 (2015) 43–55, http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.037
2. H. Yang, S.M. Koza, W. Chen, Plasmid Isoform Separation and Quantification by Anion-exchange Chromatography (AEX), Waters Application Note, 720007207, March 2021.
3. A. Kanavarioti, HPLC Methods for Purity Evaluation of Man-Made Single-Stranded RNAs, Scientific Reports 9, 2019, 1–13, https://doi.org/10.1038/s41598-018-37642-z.
4. S. Fekete, H. Yang, K. Wyndham, M. Lauber, Salt gradient and ion-pair mediated anion exchange of intact messenger ribonucleic acids, J. Chromatogr.Open 2 (2022) 100031, https://doi.org/10.1016/j.jcoa.2022.100031
5. S. Fekete, M. Lauber, Salt Plug Injection Methods for Improved Anion Exchange Analyses of Large Nucleic Acids, Waters Application Note, 720007991, July 2023.
6. A. Goyon, M. Excoffier, M.C. Janin-Bussat, B. Bobaly, S. Fekete, D. Guillarme, A. Beck, Determination of isoelectric points and relative charge variants of 23 therapeutic monoclonal antibodies, J. Chromatogr.B 1065–1066 (2017) 119–128, http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.09.033
7. A. P. Liu, Y. Yan, S. Wang, N. Li, Coupling Anion Exchange Chromatography with Native Mass Spectrometry for Charge Heterogeneity Characterization of Monoclonal Antibodies, Anal.Chem. 94 (2022) 6355–6362.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c00707
8. J.R. Thayer, et al., Identification of RNA Linkage Isomers by Anion Exchange Purification With Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Automatically Desalted Phosphodiesterase-II Digests.Anal.Biochem.399 (2010) 110–117.http://dx.doi.org/10.1016/j.ab.2009.11.009
9. J.R. Thayer, R.M. McCormick, N. Avdalovic, High-Resolution Nucleic Acid Separations by High-Performance Liquid Chromatography, in Methods in Enzymology, 1996, Academic Press.147–174.http://dx.doi.org/10.1016/s0076-6879(96)71009-1
10. A. Eon-Duval, G. Burke, Purification of Pharmaceutical-Grade Plasmid Dna by Anion-Exchange Chromatography in an Rnase-Free Process. J. Chromatogr. B, 804 (2004) 327-335.http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2004.01.033
11. K. Cook, J. Thayer,Advantages of Ion-Exchange Chromatography for Oligonucleotide Analysis.Bioanalysis, 2011.3(10): p. 1109-1120.http://dx.doi.org/10.4155/bio.11.66
12. S. G. Roussis, C. Rentel, Separation of Phosphorothioate Oligonucleotide Impurities by Wax Hplc Under High Organic Content Elution Conditions, Anal.Biochem.659 (2022) 114956, https://doi.org/10.1016/j.ab.2022.114956
13. A. Murisier, M. Lauber, S.J. Shiner, D. Guillarme, S. Fekete, Practical Considerations on the Particle Size and Permeability of Ion-Exchange Columns Applied to Biopharmaceutical Separations, J. Chromatogr.A 1604 (2019) 460487, https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.460487
14. H. Lardeux, D. Guillarme, M. Imiołek, S. Fekete, M.A. Lauber, Pressure–Enhanced Liquid Chromatography as a Suitable Approach to Improve Selectivity for Large Molecule Separations, LCGC Supp., Advances in LC Column Technology, 41 (2023) 28–34.https://doi.org/10.56530/lcgc.na.ts6090k5
15. G.V. Samsonov, V.A. Pasechnik, Ion Exchange and the Swelling of Ion- Exchange Resins, Russian Chem.Rev. 38 (1969) 547–565, https://doi.org/10.1070/ RC1969v038n07ABEH001761
16. U.M. Ingle, A.M. Lali, Significance of Porosity and Pore Accessibility for the Se- Lection of Ion Exchange Adsorbents for Chromatographic Purification of Macro- Molecules, Acta Chromatogr 29 (2017) 5–24, https://doi.org/10.1556/1326.2017.29.1.01
17. B. Gong, Y. Shen, X. Geng, Preparation of Strong Cation Exchange Packings Based on Monodisperse Poly(Glycidyl Methacrylate-Co-ethylenedimethacrylate) Particles and Their Application, J. Liq.Chromatogr.Relat.Technol.26 (2003) 963–976, https://doi.org/10.1081/JLC-120018896