액체 크로마토그래피 입문자 가이드

그림 H에서 3개의 염색된 화합물은 크로마토그램에서 시간에 따라 분리된 3개의 피크로 나타납니다. 각각은 주입 순간[시간 0]부터 피크 최대 용리 시간 사이의 경과 시간으로 측정되는 특정 위치에서 용리됩니다. 크로마토그래피 전문가는 각 피크의 머무름 시간[t_R]을 동일한 크로마토그래피 시스템[동일한 이동상 및 고정상]에서 주입된 참조 표준물질의 머무름 시간과 비교하여 각 화합물을 식별할 수 있습니다.

그림 I-1에 표시된 크로마토그램에서 크로마토그래피 전문가는 이러한 LC 시스템 조건에서 분석물인 아크릴아미드가 2.85분[머무름 시간]에 컬럼에서 분리되고 용리된다는 사실을 알고 있습니다. 아크릴아미드를 함유한 새로운 샘플이 동일한 조건에서 LC 시스템에 주입될 때마다 피크는 2.85분에 나타납니다[그림 I-2의 샘플 B 참조].

[일부 화합물이 다른 화합물보다 더 느리게 움직이는지[더 잘 머무르는지] 보다 명확하게 이해하려면 HPLC 분리 모드를 검토하십시오].

어떤 물질인지 확인되면 다음으로 중요한 정보는 샘플에 포함된 각 화합물의 양입니다. 크로마토그램과 검출기의 관련 데이터는 각 화합물의 농도 계산에 사용됩니다. 검출기는 기본적으로 플로우 셀을 통과할 때 화합물 띠의 농도에 반응합니다. 농도가 높을수록 신호는 더 강해집니다. 이것은 베이스라인 위의 더 큰 피크 높이로 나타납니다.

그림 I-2에서 샘플 A와 B의 크로마토그램은 같은 시간 척도로 서로 겹쳐져 있습니다. 두 실행 모두에 동일한 양의 샘플을 주입했습니다. 두 크로마토그램 모두 2.85분의 머무름 시간[t_R]에 피크를 표시하여 각 샘플에 아크릴아미드가 포함되어 있음을 나타냅니다. 그러나 샘플 A는 아크릴아미드에 대해 훨씬 더 큰 피크를 나타냅니다. 피크 아래의 면적[피크 면적 수]은 이것이 나타내는 화합물의 농도를 나타내는 척도입니다. 이 면적 값은 컴퓨터 데이터 스테이션에서 자동으로 적분 및 계산됩니다. 이 예에서 샘플 A의 아크릴아미드 피크 면적은 샘플 B의 10배입니다. 참조 표준물질을 사용하면 샘플 A에 10피코그램의 아크릴아미드가 포함되어 있음을 확인할 수 있습니다. 이는 샘플 B에 들어 있는 양[1피코그램]의 10배입니다. 두 샘플에는 1.8분에 용리되는 또 다른 피크[확인되지 않음]가 있습니다. 두 샘플에서 이 피크의 면적은 거의 같기 때문에 두 샘플에서 이 미지의 화합물 농도는 동일할 수 있습니다.

등용매(Isocratic) 및 그래디언트 LC 시스템 작동

HPLC에서는 두 가지 기본 용리 모드가 사용됩니다. 첫 번째는 등용매(Isocratic) 용리라고 합니다. 이 모드에서는 순수 용매 또는 혼합물의 이동상이 실행 내내 동일하게 유지됩니다. 일반적인 시스템을 그림 J-1에 개략적으로 나타냈습니다.

두 번째 유형은 그래디언트 용리라고 하며, 이름에서 알 수 있듯이 분리 중에 이동상 조성이 변합니다. 이 모드는 광범위한 크로마토그래피 극성에 걸쳐 있는 화합물을 포함하는 샘플에 유용합니다[HPLC 분리 모드에 관한 섹션 참조]. 분리가 진행됨에 따라 이동상의 용리 강도가 증가하여 더 강하게 머무르는 샘플 성분이 용리됩니다.

그림 J-2에 표시된 가장 간단한 예시에는 두 개의 용매 용기와 두 개의 펌프가 있습니다. 각 펌프의 속도는 그래디언트 컨트롤러에 의해 제어되어 분리 과정에서 더 많거나 적은 용매를 전달합니다. 두 흐름은 믹서에서 결합되어 시간이 지남에 따라 컬럼으로 전달되는 실제 이동상 조성을 생성합니다. 처음에 이동상에는 약한 용매[용매 A]의 함량이 더 높습니다. 시간이 지나면서 강한 용매[용매 B]의 비율이 미리 정해진 시간표에 따라 증가합니다. 그림 J-2에서 믹서는 펌프 다운스트림에 있습니다. 따라서 높은 압력에서 그래디언트가 생성됩니다. 다른 HPLC 시스템은 단일 펌프보다 앞서 낮은 압력에서 여러 용매 흐름을 혼합하도록 설계되었습니다. 그래디언트 비율 조절 밸브는 4개의 용매 용기에서 용매를 선택하여 시간이 지남에 따라 이동상의 강도를 변화시킵니다[그림 J-3 참조].

HPLC 스케일[분석, 분취 및 프로세스]

HPLC가 샘플에 존재하는 화합물을 식별하고 정량화하는 데 사용할 수 있는 분석 데이터를 제공한다는 것을 설명했습니다. 그러나 HPLC는 검출기 플로우 셀의 다운스트림에서 분획 분취기(fraction collector)를 사용하여 원하는 양의 각 화합물을 정제하고 수집하는 데도 사용할 수 있습니다. 이 과정을 분취용 크로마토그래피라고 합니다[그림 K 참조].

분취용 크로마토그래피에서는 컬럼에서 용리되는 개별 분석물을 수집할 수 있습니다[예: 이 예에서는 순서대로 노란색, 빨간색, 파란색].

분획 분취기(fraction collector)는 지정된 시간 동안 정제된 분석물이 포함된 용리액을 선택적으로 수집합니다. 용기는 각각 하나의 분석물 피크만 수집하도록 이동됩니다.

분석자는 순도 수준과 양에 대한 목표를 결정합니다. 샘플의 복잡성과 매트릭스 구성성분 대비 원하는 분석물의 특성과 농도에 대한 정보를 고려하여, 목표에 따라 처리해야 하는 샘플의 양과 HPLC 시스템의 용량이 결정됩니다. 일반적으로 샘플 크기가 증가함에 따라 더 큰 HPLC 컬럼과 더 높은 체적-유량 용량의 펌프가 필요합니다. HPLC 시스템의 용량을 결정하는 것을 HPLC 스케일 선택이라고 합니다. 표 A에는 다양한 HPLC 스케일과 크로마토그래피 목표가 나와 있습니다.

HPLC 고정상과 이동상의 특정한 조합에서 선택성을 극대화할 수 있어야(관심 대상인 두 샘플 성분 간에 가능한 최대 분리 달성) 분리 스케일에 대한 요구 사항을 정확하게 결정할 수 있습니다[HPLC 분리 모드에 대한 논의 참조]. 그러면 용량은 주입할 샘플의 양으로 컬럼 부피[V_c]를 조정하고 적절한 입자 크기를 선택하는 문제로 귀착됩니다[압력과 컬럼 효율 결정; 분리능에 대한 논의 참조]. 베드 길이[L]와 내부 직경[i.d.]의 함수인 컬럼 부피에 따라 담을 수 있는 충전재[입자]의 양이 결정됩니다(그림 L 참조).

일반적으로 HPLC 컬럼은 길이[L]가 20mm~500mm이고 내부 직경[i.d.]이 1mm~100mm입니다. 크로마토그래피의 스케일이 증가함에 따라 컬럼 치수, 특히 단면적도 증가합니다. 처리량을 최적화하려면 이동상 유량이 단면적에 비례하여 증가해야 합니다. 작은 입자 크기가 더 큰 분리능을 얻는 데 바람직하다면 높은 역압에서 더 높은 이동상-체적 유량을 유지하도록 펌프를 설계해야 합니다. 표 B에는 컬럼 내경을 선택하는 몇 가지 간단한 지침과 각 스케일의 크로마토그래피에 권장되는 입자 크기 범위가 정리되어 있습니다.

예를 들어, 반분취 스케일[빨간색 X]에서는 5-15μm 입자를 포함하는 내부 직경이 10-40mm인 컬럼을 사용합니다. 그러면 각 실행 중에 처리해야 하는 정제된 화합물의 양과 필요한 분리능에 따른 컬럼 길이를 계산할 수 있습니다.