시간에 따른 피크 모양 변화

이 시리즈의 처음 세 부분에서 설명한 바와 같이 피크 모양 문제는 HPLC 분석에서 일반적인 문제입니다. 피크는 가우스 모양에 따라 대칭을 이루는 것이 이상적입니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. 피크의 대칭성은 그림 1에 표시된 것처럼 USP 테일링 인자(T)의 계산을 통해 정량화할 수 있습니다. 테일링 인자가 1이면 완벽한 대칭성을 나타내며, 1보다 작은 값은 프론팅, 1보다 큰 값은 테일링이라고 합니다. 많은 분석법에서는 모든 피크의 테일링 인자가 지정된 범위 내에 있어야 합니다. 테일링 인자가 1에서 크게 벗어날 경우 서로 가까이 용리되는 피크의 분리능을 감소시켜 피크의 적분을 더 어렵게 만들 수 있습니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. 또한 피크의 대칭성이 좋지 않은 경우, 피크가 실제보다 더 넓어져 피크의 높이가 감소하는 경우가 일반적입니다. 저농도로 존재하는 분석 물질의 검출 및 정량화와 관련된 응용 분야에서, 이는 결과의 정밀도와 정량화 및 검출 한계의 저하로 이어집니다.

많은 응용 분야에서는 샘플 그룹을 분석하기 위해 분석법이 반복적으로 사용되군 합니다. 정확한 결과를 얻으려면 일련의 분석 기간 동안 컬럼이 일관된 피크 너비와 테일링 인수를 제공하는 것이 중요합니다. 그러나 항상 가능하지는 않습니다. 그림 2에 표시된 예는 4개 화합물의 등용매 분리 결과로서, 100회 주입 후 피크 너비와 피크 대칭성의 변화를 보여줍니다. C₁₈-실리카 컬럼은 pH 7.0 인산칼륨 완충액과 메탄올(35:65 v/v)이 포함된 이동상과 40°C의 컬럼 온도를 사용했습니다. 처음 세 부분에서 설명한 바와 같이, HPLC 시스템, 이동상, 샘플 및 컬럼의 문제를 포함하여 피크 대칭성의 변화 원인은 여러 가지가 있을 수 있습니다 [J. W. Dolan 및 L. R. Snyder, LC 시스템 문제 해결, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. 앞서 논의한 바와 같이, 문제 해결을 위한 좋은 출발점은 크로마토그램을 주의 깊게 분석하여 피크 모양의 변화가 모든 피크에서 나타나는지 혹은 일부 피크에서 나타나는지 관찰하는 것입니다. 그림 2에 표시된 크로마토그램에서 가장 큰 변화는 노르트립틸린(피크 1)에서 나타났으며, 아미트립틸린(피크 4)의 변화는 비교적 작았습니다. 이 두 피크에서도 머무름 시간이 크게 증가했습니다. 다른 두 피크(피크 2, 2-메틸나프탈렌 및 피크 3, 아세나프텐)는 더 작은 변화를 나타냅니다. 특히, 노르트립틸린과 아미트립틸린은 염기성 화합물인 반면, 2-메틸나프탈렌과 아세나프텐은 비이온성 화합물입니다. 그림 2B에서와 같이, 염기성 화합물의 피크만 테일링 및 머무름 시간 증가를 보이는 경우, 가능한 원인에는 이동상 또는 컬럼의 변화가 포함됩니다. 이 중에서 그림 2B의 크로마토그램에 나타나는 변화를 일으키는 요인이 무엇인지 확인하기 위해, 해당 컬럼을 동일한 유형의 새로운 컬럼으로 교체했습니다. 동일한 이동상을 사용하여, 그림 2C에 표시된 크로마토그램을 얻었습니다. 이 크로마토그램은 원래 컬럼에서 초기에 얻은 것과 유사한 분리를 보여주며, 주입 100에서 테일링이 증가하는 원인이 컬럼의 변화임을 나타냅니다.

컬럼은 온도(20~45°C) 및 pH(2~8)의 권장 범위 내에서 사용되었기 때문에 이러한 상대적으로 급격한 열화는 예상되지 않았습니다. 그러나 유기용매(메탄올)를 첨가하면 수용성 완충액의 pH가 변한다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. pH 7.05 인산염 수용액을 같은 양의 메탄올로 희석하면 pH가 8.29로 증가하는 것으로 보고되었습니다 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802–1809]. 그림 2의 크로마토그램을 생성하는 데 사용된 이동상에는 65%의 메탄올이 포함되어 있으므로, 이동상의 pH는 훨씬 높아지고, 권장 제한인 8보다 높을 것으로 예상됩니다. 권장 제한보다 높은 이동상 pH를 사용하면 고정상의 가수 분해로 이어질 수 있으며, 이로 인해 결합된 그룹이 손실되고 추가적인 실라놀이 형성될 뿐만 아니라 효율성이 저하될 수 있습니다 [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]. 이는 그림 2B에 표시된 피크 모양 및 머무름이 변경된 이유일 가능성이 높습니다.

pH가 8보다 큰 이동상을 사용할 경우 C₁₈-실리카 컬럼보다 더 확실한 선택은 하이브리드 유기-무기 입자로 채워진 컬럼입니다 [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788]. 이를 입증하기 위해 하이브리드 입자 컬럼(XBridge BEH C₁₈)에 동일한 방법을 사용했으며, 그림 3에 표시된 결과가 제공되었습니다. 하이브리드 입자 컬럼의 알칼리 안정성이 개선되었으므로 120회 주입 동안 피크 모양에서 큰 변화가 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 특히 권장 pH 및 온도 제한에 가깝게 컬럼을 사용할 경우 결합상 가수분해로 인해 시간 경과에 따른 피크 모양 변화가 발생할 수 있음을 보여줍니다. 중요한 것은 이동상 pH가 컬럼의 권장 범위 내에 있는지 확인할 때 수용성 완충액의 pH에 대한 유기 용매의 영향을 고려해야 한다는 것입니다.