Cambios en la forma de los picos a lo largo del tiempo

Como se describió en las tres primeras partes de esta serie, los problemas en la forma de los picos son un problema común en los análisis de HPLC. Idealmente, los picos deberían ser simétricos, con forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. La simetría de un pico se puede cuantificar calculando el factor de asimetría USP (T), como se ilustra en la figura 1. Un factor de asimetría de 1 indica una simetría perfecta, mientras que los valores inferiores a 1 se denominan asimetría frontal y, los valores superiores a 1, asimetría de cola. Muchos métodos requieren que los factores de asimetría de todos los picos estén dentro de un intervalo especificado. Los factores de asimetría que se desvían significativamente de 1 pueden disminuir la resolución de los picos que eluyen cerca, lo que dificulta la integración [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. Además, cuando la simetría de los picos es deficiente, el pico suele ser más ancho de lo que debería ser, lo que reduce la altura de los picos. En aplicaciones que implican la detección y cuantificación de analitos presentes a bajas concentraciones, esto puede disminuir la precisión de los resultados, así como los límites de cuantificación y detección.

En muchas aplicaciones, un método se utiliza repetidamente para analizar un grupo de muestras. Para garantizar la obtención de resultados exactos, es importante que la columna proporcione anchuras de los picos y factores de asimetría consistentes durante el conjunto de análisis. Sin embargo, esto no siempre se puede lograr en la práctica. En el ejemplo que se muestra en la figura 2, una separación isocrática de cuatro compuestos mostró cambios en la anchura de los picos y la simetría de los picos después de 100 inyecciones. Se utilizó una columna de sílice C₁₈ con una fase móvil que contenía tampón de fosfato potásico a pH 7,0 y metanol (35:65 v/v) y una temperatura de columna de 40 °C. Como se ha comentado en las tres primeras partes, hay varias causas posibles de cambios en la simetría de los picos, incluidos problemas con el sistema HPLC, la fase móvil, la muestra y la columna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, Nueva York, 1989, pp. 385-420]. Como se ha comentado anteriormente, un buen punto de partida para la resolución de problemas es analizar detenidamente los cromatogramas para observar si el cambio en la forma de los picos se observa en todos los picos o solo en algunos de ellos. En los cromatogramas mostrados en la figura 2, el mayor cambio se observa para la nortriptilina (pico 1), mientras que se observa un cambio menor para la amitriptilina (pico 4). También son evidentes los aumentos significativos en el tiempo de retención para estos dos picos. Los otros dos picos (pico 2, 2-metilnaftaleno y pico 3, acenafteno) muestran cambios menores. En particular, la nortriptilina y la amitriptilina son compuestos básicos, mientras que el 2-metilnaftaleno y el acenafteno no son ionizables. Cuando solo los picos de los compuestos básicos muestran mayores asimetrías y tiempos de retención, como en la figura 2B, las causas probables incluyen un cambio en la fase móvil o en la columna. Para determinar cuál de estos causaba los cambios observados en el cromatograma de la figura 2B, la columna se sustituyó por una nueva columna del mismo tipo. Con la misma fase móvil, se obtuvo el cromatograma que se muestra en la figura 2C. Este cromatograma muestra una separación similar a la obtenida inicialmente en la columna original, lo que indica que la causa del aumento de asimetría en la inyección 100 fue un cambio en la columna.

Debido a que la columna se utilizó dentro de los intervalos recomendados de temperatura (20-45 °C) y pH (2-8), no se esperaba este deterioro relativamente rápido. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el pH del tampón acuoso cambia cuando se añade el eluyente orgánico (metanol). Se ha informado de que la dilución de una solución acuosa de fosfato de pH 7,05 con un volumen igual de metanol hacía que el pH aumentara a 8,29 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802–1809]. Debido a que la fase móvil utilizada para producir los cromatogramas de la figura 2 contenía un 65 % de metanol, se esperaría que el pH de la fase móvil fuera aún más alto y por encima del límite recomendado de 8. El uso de un pH de la fase móvil por encima del límite recomendado puede provocar la hidrólisis de la fase estacionaria, lo que provoca la pérdida de grupos enlazados y la formación de silanoles adicionales, así como una pérdida de eficacia [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]. Esta es probablemente la razón de los cambios en la forma de los picos y la retención que se observan en la figura 2B.

Cuando se utilizan fases móviles con un pH superior a 8, una opción más robusta que una columna de sílice C₁₈ es una columna rellena con partículas híbridas orgánicas-inorgánicas [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788]. Para demostrar esto, se utilizó el mismo método con una columna de partículas híbridas (XBridge BEH C₁₈), dando los resultados que se muestran en la figura 3. Con la mejora de la estabilidad alcalina de la columna de partículas híbridas, no se observaron cambios significativos en la forma de los picos a lo largo de 120 inyecciones. Estos resultados muestran que los cambios en la forma de los picos a lo largo del tiempo pueden deberse a la hidrólisis de la fase enlazada, especialmente cuando se utiliza una columna cercana a los límites de pH y temperatura recomendados. Es importante tener en cuenta el efecto del eluyente orgánico sobre el pH del tampón acuoso al comprobar si el pH de la fase móvil está dentro del intervalo recomendado para la columna.