峰型隨時間變化

如本系列文章的前三部分所述，峰型問題是HPLC分析中的常見問題。理想的層析峰應呈現對稱的高斯形狀[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。計算USP拖尾因子(T)可以將峰型對稱性量化，如圖1所示。拖尾因子的值等於1表示完全對稱，小於1稱為前傾峰，大於1則稱為拖尾峰。許多方法要求所有層析峰的拖尾因子皆須保持在指定範圍內。拖尾因子若明顯偏離1，可能會降低相鄰沖堤峰的解析度，增加積分難度[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。此外，層析峰對稱性若較差，峰寬通常會大於預期，導致峰高降低。在牽涉到低濃度分析物偵測與定量的應用中，這種情況可能會降低結果精密度，以及定量極限與偵測極限。

許多應用情況會重複應用同一種方法分析一組樣品。為確保結果準確，管柱一定要在分析全程提供一致的峰寬和拖尾因子。不過，這一點在實際分析中未必能確實做到。圖2所示範例是四種化合物的等度分離處理，結果顯示進樣100次後，峰寬和峰對稱性均發生變化。該分析使用C₁₈矽膠管柱，移動相為pH 7.0的磷酸鉀緩衝液和甲醇(35:65 v/v)，管柱溫度40 °C。前三部分討論過，層析峰對稱性出現變化的可能原因有好幾種，包括HPLC系統、移動相、樣品和管柱的問題[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。如前所述，要進行疑難排解，建議先仔細分析層析圖，從中觀察峰型變化出現是在所有峰抑或部分峰。圖2所示層析圖中，去甲替林（峰1）的變化最大，阿米替林（峰4）次之。這兩個峰的滯留時間也明顯增加。另外兩個峰（峰2：2-甲基萘；峰3：乙烷合萘）變化較小。請注意，去甲替林及阿米替林屬於鹼性化合物，而2-甲基萘和乙烷合萘則不可離子化。若只有鹼性化合物出現層析峰拖尾和滯留時間增加，如圖2B所示，原因可能包括移動相或管柱出現變化。為判斷圖2B所示層析圖呈現如此變化的原因，將管柱更換成同類型的新管柱。移動相不變的情況下，得到如圖2C所示的層析圖。這張層析圖顯示的分離處理結果與最初使用原始管柱得到的結果相似，表示第100次進樣時拖尾增加是管柱變化所致。

由於是在建議的溫度(20–45 °C)與pH值(2–8)範圍內使用管柱，因此預期不會出現劣化速度相對偏快的情形。但請務必注意，添加有機溶劑（甲醇）時，水性緩衝液的pH值會發生變化。曾有報告指出，以等體積甲醇稀釋pH 7.05的磷酸鹽水溶液，會導致pH值增加到8.29 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal.Chem.72 (2000) 1802–1809]。圖2所示層析圖中使用的移動相含65%甲醇，因此，移動相的pH值應會更高，甚至高於建議極限8。移動相pH值高於建議極限可能會導致固定相水解，造成鍵結基團損失，形成額外的矽醇基，進而降低效率[J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]。這可能是圖2B所示峰型和滯留時間發生變化的原因。

移動相pH值大於8時，填充雜化有機-無機顆粒的管柱與C₁₈矽膠管柱相比，效能更穩定[K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal.Chem. 75 (2003) 6781–6788]。為證明這一點，使用雜化顆粒管柱(XBridge BEH C₁₈)結合相同的方法進行分析，結果如圖3所示。雜化顆粒管柱的鹼穩定性有所改善，因此，進樣120次後未觀察到峰型出現明顯變化。這些結果表示，峰型隨時間變化可能是鍵結相水解所致，管柱使用條件接近建議的pH值和溫度極限時尤其如此。重要的是，檢查移動相pH值是否在管柱的建議範圍內時，應考慮有機溶劑對水性緩衝液pH值的影響。