示範使用Andrew+移液機械臂執行自動化樣品製備的LC-MS亞硝胺不純物定量效能

LC-MS分析方法開發要求樣品製備流程靈活且可再現，以利完成準確且可靠的分析物定量作業。本文強調使用Andrew+移液機械臂結合OneLab雲端軟體如何自動化產生校正曲線，使用ACQUITY UPLC I-Class PLUS系統和Xevo TQ-XS質譜儀對亞硝胺不純物進行LC-MS定量分析，獲取準確且可再現的結果。

優勢

• 準確、精準且可靠的分析定量效能
• 簡單易用、節省時間
• 提高效率並減少失誤，達到節約成本的目的
• 避免反覆移液
• 自動化進行方法轉移

樣品製備對實驗室分析人員而言往往是最耗時卻又最關鍵的步驟。在樣品製備步驟中，稍有閃失就會影響整個分析，有可能會導致效能出現高度異常，最嚴重的情況還可能造成分析失敗。此外，這些分析方法的開發、最佳化以及執行等作業著實耗時，並且難以在不同的科學家以及實驗室之間轉移¹。     

所有定量分析都需要製備校正標準品和品質管控(QC)樣品。製備這些樣品時，會採用以濃縮溶液依序（或連續）稀釋分析物的基本技術²。 樣品製備往往並不困難，但需反覆作業而且相當耗時，要求製備過程保持一致，才能讓分析方法實現可靠的效能。因此，這項任務非常適合使用實驗室自動化作業。讓分析人員有空處理其他任務、簡化樣品製備流程、減少發生人為錯誤的可能性，確保分析方法效能的一致性。

本應用簡報的目標在於使用Andrew+移液機械臂開發一種自動化樣品製備方法用於N-亞硝胺不純物的LC-MS定量作業並證明方法效能。N-亞硝胺不純物有致癌性並且存在於許多商品和藥物中，因此，無論是在藥物開發及製造的過程中以及結束之後，都必須運用穩定可靠的樣品製備與分析作業進行例行定量。

依據應用手冊720006899EN中說明的樣品製備方法，為Andrew+移液機械臂建立校正樣品製備實驗步驟。簡而言之，我們使用水/甲醇溶液(80/20)分別製備了三個含六種亞硝胺不純物（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA、NDBA和NMBA）的校正曲線樣品，以1 µg/mL濃縮儲備溶液在96孔樣品採集盤（P/N：186005837）中製備。試劑製備實驗步驟和校正曲線實驗步驟在OneLab中產生，這是一套在Andrew+移液機械臂上設計和執行實驗步驟時所採用的雲端軟體。開發的實驗步驟不但能執行校正曲線樣品製備（濃度範圍0.025–100 ng/mL）的所有步驟，還能提供製備階段所用耗材與試劑的一切資訊。圖1強調這項分析所用OneLab連續稀釋/校正曲線(0.025–100 ng/mL)的產生方式。產生亞硝胺校正曲線後，使用矽膠/PTFE製96孔蓋墊（P/N：186006332）封住分析盤。使用Waters Xevo TQ-XS串聯質譜儀結合ACQUITY UPLC I-Class PLUS系統，以MassLynx軟體進行控制，對製備的樣品執行LC-MS/MS分析。應用手冊720006899EN中也有詳細描述LC-MS方法的完整細節。

依據小分子分析方法開發準則^3,4，開發的分析方法必須要能夠證明線性（相關係數或R² ≥0.98）、準確度(±15%)以及精密度(±15%)。使用Andrew+移液機械臂透過OneLab樣品製備方法製備的六(6)種N-亞硝胺不純物在後續的LC-MS分析中全數輕鬆達到這些標準。表1示範的是平均(N=3)校正效能。六種N-亞硝胺不純物的線性動態範圍介於0.025–50 ng/mL之間，使用簡單1/x權重的線性擬合≥0.999。此外，平均準確度介於90.7–108.0%之間，RSD介於0.2–14.0%之間，表示這種方法的準確度和再現性都相當高。圖2強調其中三種亞硝胺不純物的代表性校正曲線。 

這套以OneLab建立並在Andrew+移液機械臂上執行的自動化方法，能夠執行簡單的連續稀釋，為亞硝胺不純物分析產生校正曲線，不需要分析人員人工處理。這套用途廣泛的方法可以獨立使用，也可以結合更精密的樣品工作流程，進行穩定的LC-MS定量分析。此外，OneLab方法可以溯源，轉移起來也相當容易，因此能夠保證方法再現效能：不分時間、不分使用者、不分系統，也不分實驗室。 

1. Christler, Anna & Felföldi, Edit & Mosor, Magdalena & Sauer, Dominik & Walch, N. & Dürauer, Astrid & Jungbauer, Alois.(2020).Semi-Automation of Process Analytics Reduces Operator Effect.Bioprocess and Biosystems Engineering.43.10.1007/s00449-019-02254-y.
2. Accurate and Consistent Serial Dilutions Made Easy with Andrew.Retrieved (22Feb2021) from https://www.andrewalliance.com/wp-content/uploads/2016/10/5_Serial_Dilutions_HD_20161005.pdf
3. Viswanathan, C. T.; Bansal, S.; Booth, B.; DeStefano, A. J.; Rose, M. J.; Sailstad, J.; Shah, V. P.; Skelly, J. P.; Swann, P. G.; Weiner, R. Quantitative Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for Chromatographic and Ligand Binding Assays.Pharm.Res.2007, 24, 1962–1973.
4. Bansal, S.; DeStefano, A. Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small Molecules.AAPS J. 2007, 9, E109–114.