Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

L’espressione “proteina e peptide” si riferisce a un campione relativamente puro proveniente da un bioreattore o da un processo di purificazione. Questi campioni includono poco o nessun materiale aggiuntivo non proteico. La generazione di amminoacidi liberi da una proteina o da un peptide intatto è un passaggio fondamentale nella produzione di dati utili e accurati per l’analisi degli amminoacidi. Per consentire questa generazione, è necessario scomporre o idrolizzare una proteina o un peptide nei suoi singoli costituenti amminoacidi.

In questa sezione sono presentate le procedure di base per l’idrolisi di proteine e peptidi in fase vapore e liquida, sottolineando le considerazioni preliminari necessarie per un’analisi ottimale.

Ulteriori sottosezioni trattano procedure di idrolisi alternative per l’analisi di campioni speciali contenenti amminoacidi che non sono compatibili con le tecniche di idrolisi acida standard (HCl): triptofano e cisteina/cistina.

In questa sezione ci concentreremo sull’idrolisi acida per HCl, che è il metodo più comune utilizzato nella preparazione di campioni di amminoacidi. Tuttavia, affinché i campioni proteici siano completamente idrolizzati (con qualsiasi metodo), è necessario prendere in considerazione diversi fattori. I tamponi neutralizzanti, così come eventuali solidi presenti, devono essere presi in considerazione nelle stime procedurali. Inoltre, la velocità o l’entità dell’idrolisi variano a seconda degli amminoacidi presenti nelle proteine, il che richiede studi su base temporale del processo di idrolisi e la validazione adeguata dei metodi complessivi. La manipolazione corretta dei campioni durante l’idrolisi garantisce risultati di alta qualità. Le difficoltà più comuni in questo tipo di analisi derivano generalmente da una tecnica impropria o poco accurata. Per un’idrolisi efficace con questo metodo, è necessario anzitutto rispondere a quattro domande:

1. È necessaria la diluizione del campione?
2. Qual è il volume del campione da erogare nelle provette per idrolisi?
3. Qual è il volume specifico di acido da aggiungere alle provette (solo idrolisi in fase liquida)?
4. Qual è la quantità di standard interno se utilizzata in questa fase?

Nelle sezioni che seguono sono descritte le determinazioni necessarie e sono forniti esempi di calcoli, ove opportuno.

2.1.1 Considerazioni preliminari

A meno che il campione non sia limitato, nell’idrolisi dovrebbero essere presenti tra 2 e 25 µg di proteine, per minimizzare gli effetti della contaminazione. Indipendentemente dalla modalità di idrolisi, si consigliano 20 µg.

• Non deve esserci eccesso di materiale solido nel campione. Questo materiale può interferire con l’idrolisi in fase vapore.
• Se nel campione con la proteina sono presenti altri solidi, questi pesi devono essere aggiunti alla proteina nella concentrazione di solidi per volume di acido.
• La concentrazione netta dell’acido nella reazione di idrolisi deve essere ~6 N.
• Si consiglia l’utilizzo di uno standard interno (ad esempio, Nva [norvalina]) rispetto agli standard esterni.
• Lo standard interno deve essere aggiunto prima dell’idrolisi. Può essere aggiunto durante la preparazione del campione, se opportuno, o aggiunto all’acido che viene quindi erogato nelle provette per idrolisi. In genere, la quantità di standard interno viene calcolata in modo da corrispondere alla quantità di standard utilizzata per la calibrazione.
• Il fenolo viene aggiunto all’acido utilizzato per l’idrolisi in modo da fungere da eliminatore di ossigeno.

2.1.2 Diluizione del campione (se necessario) prima dell’idrolisi liquida

• Introdurre almeno 10 µL di campione (diluito o meno) nella provetta per idrolisi. Qualsiasi valore inferiore contribuirà a una quantità inaccettabile di errore a causa dell’incertezza volumetrica.
• Nell’idrolisi deve esserci anche un eccesso ponderale di acido pari a 10-100 volte quello del campione. Con un campione eccessivamente concentrato, l’idrolisi potrebbe non avvenire in modo efficace. In questi casi il campione deve essere diluito. Assicurarsi che nell’idrolisi liquida vi sia un eccesso ponderale di acido sui solidi ∼100 volte superiore.
• Assicurarsi che l’eccesso molare di acido rispetto ai tamponi nel campione sia pari a 25 volte. Moltiplicare per 3 le moli di tampone fosfato per tenere conto dei tre gruppi titolabili.
• Il volume totale per l’idrolisi non deve superare il 50% della capacità totale della provetta o del recipiente di idrolisi. Per le provette da 6 x 50 mm il volume massimo consigliato è di 100 µL. Includere i volumi dell’acido e dello standard interno in questo volume totale finale.

Esempio di calcolo: determinazione del requisito di diluizione

Per una proteina di 5 mg/mL in 150 mM di NaCl, saranno determinati la quantità di solidi (inclusi i sali) e il fattore di diluizione.

Il primo passaggio consiste nel determinare la quantità totale di solidi nel campione. Questo valore si può calcolare moltiplicando la concentrazione di proteine (µg/µL) per la concentrazione ponderale del sale (concentrazione x PM) per una quantità totale di solidi.

Il passaggio successivo consiste nel determinare la diluizione necessaria per il target di 20 µg di proteine (in 20 µL). A tale scopo, moltiplicare la quantità/volume desiderati per la concentrazione inversa del campione. Ciò si traduce in un rapporto di diluizione 1:5 necessario per il campione sopra descritto.

2.1.3 Volume di campione da erogare nella provetta per idrolisi

Il volume totale consigliato per l’idrolisi è di 100 µL (se si utilizzano provette da 6 x 50 mm), con un volume di campione compreso tra 10 e 20 µL. Questo volume di campione, diluito o meno, dipende dal tipo di idrolisi eseguita e segue queste linee guida:

• Per l’idrolisi in fase vapore seccare il campione sotto vuoto fino a ottenere un film sottile sul fondo della provetta per idrolisi.
• Idrolisi liquida: erogare il volume appropriato per idrolizzare almeno 2 µg di proteine nella provetta per idrolisi oppure, da una quantità maggiore di campione (fino a 25 µg di proteine), ricostituire con una quantità di 0,1 N HCl sufficiente a trasferire ~0,2 µg di proteine (idealmente in 10 µL) all’idrolisi.

È importante notare, ancora una volta, che minore è la quantità di proteine nell’aliquota di campione, più l’analisi può essere vulnerabile alla contaminazione.

2.1.4 Volume di acido da aggiungere all’idrolisi.

Il volume di acido aggiunto all’idrolisi è fondamentale. Ciò è particolarmente vero per l’idrolisi in fase liquida. Le linee guida per il volume di acido sono riportate di seguito, con un esempio esaustivo.

• Idrolisi in fase vapore:
  • Aggiungere 200 µL di 6 N HCl con fenolo 0,1-0,5% sul fondo del recipiente di idrolisi. (Se si utilizza una workstation di idrolisi non proprietaria, aggiungere il volume consigliato dal fornitore. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alle sezioni 4 e 5.)
• Idrolisi in fase liquida (vedere l’esempio seguente):
  • Assicurarsi che la concentrazione finale dell’acido sia pari a 6 N dopo l’aggiunta di fenolo.
  • Assicurarsi che l’eccesso molare di acido sia sufficiente (~25 volte) a neutralizzare i tamponi.
  • Assicurarsi che l’eccesso ponderale di acido rispetto ai solidi totali sia sufficiente (~100 volte). Includere in questa stima la matrice del campione e altre specie solide oltre alla proteina.

Esempio di calcolo: determinazione del volume di acido da aggiungere a un’idrolisi liquida

Seguendo le linee guida riportate sopra, la quantità minima di acido aggiunta per l’idrolisi deve superare di 25 volte la concentrazione del tampone e di 100 volte l’eccesso di peso del campione. Pertanto, per determinare il volume di acido occorrente, è necessario calcolare quanto segue:

1. Quantità di tampone presente
2. Quantità di acido necessaria per la neutralizzazione (25x) del tampone nel campione
3. Conversione di quantità di acido in volume
4. Solidi totali nel campione.
5. Quantità minima di acido richiesta per erogare l’acido in eccesso target sul campione (100x)
6. Conversione di quantità di acido in volume
7. Quantità totale di acido richiesta (somma di neutralizzazione ed eccesso)

Per una proteina con concentrazione pari a 2,1 mg/mL in Na/K₂PO₄ 2 mM:

La quantità di tampone in ciascuna provetta viene determinata moltiplicando la concentrazione molare del tampone per il numero di gruppi titolabili (tre per il tampone fosfato) e regolandola quindi in base al volume totale del campione erogato, in questo caso 10 µL.

Ogni provetta conterrà 60 nmol di tampone.

Successivamente, l’eccesso di 25 volte viene determinato moltiplicando la quantità per 25.

Questo numero corrisponde alle moli di acido tampone necessarie per una neutralizzazione efficace.

Le moli di tampone necessarie per la neutralizzazione devono quindi essere convertite in un volume di acido da aggiungere a ciascuna provetta.

Per questo campione, un volume di 0,25 µL neutralizza efficacemente il tampone.

Per ottenere un eccesso di acido pari a 100 volte il campione, è necessario determinare la quantità totale di solidi nel campione. I solidi totali saranno la proteina più il tampone più qualsiasi altro materiale presente. In questo caso, il campione è una proteina purificata.

Questa determinazione può essere eseguita moltiplicando la concentrazione di proteine (µg/µL) per la concentrazione ponderale del sale (concentrazione x PM) per una quantità totale di solidi.

Il totale dei solidi per questo campione è pari a 24,9 µg.

Per determinare l’eccesso di acido pari a 100 volte, moltiplicare il totale di solidi per 100.

Infine, convertire l’eccesso di peso in un volume di 6 M HCl da aggiungere a ciascuna provetta moltiplicando il peso per il peso per mole dell’acido per la molarità dell’acido.

In questo caso, 11,4 µL di 6 M HCl produrranno un eccesso di acido 100 volte superiore sul campione.

Il volume finale di acido da aggiungere a ciascuna provetta è la somma dei volumi necessari per neutralizzare il tampone del campione e fornire l’eccesso di 100 volte:

Per garantire un’idrolisi efficace è necessario un volume di 11,65 µL di 6 M HCl. Questo volume può essere arrotondato per eccesso al volume che può essere trasferito con precisione.

2.1.5 Standard interno (IS)

L’uso di uno standard interno (IS) compensa al meglio l’idrolisi variabile dei singoli amminoacidi del campione. La norvalina (Nva) è uno standard interno comunemente utilizzato.

Quando si utilizza uno standard interno:

• Può essere preparato ed erogato nel campione.
• Può essere aggiunto separatamente dal campione.
• Può essere preparato ed erogato con l’acido.
• Assicurarsi di preparare lo standard interno in modo che il volume di iniezione di 1 µL sullo strumento fornisca in colonna la stessa quantità del campione.

Per determinare la quantità di IS necessaria nel campione di partenza, il calcolo parte dalla quantità desiderata di IS necessaria nel campione. Nell’ambito di questo calcolo è importante considerare il passaggio della derivatizzazione.

Esempio di calcolo: determinazione della quantità di standard interno per un campione

La stabilità intrinseca totale viene determinata, a ritroso, moltiplicando la quantità di IS necessaria nel campione finale per il fattore di diluizione della derivatizzazione e il campione ricostituito nella provetta di idrolisi. In questo esempio sono necessarie 25 pmol di IS nel campione derivatizzato finale; il campione viene diluito 10 volte durante la derivatizzazione e 5 volte la diluizione del campione prima della derivatizzazione. Pertanto:

Ciò indica che sono necessarie 1250 pmol di IS nel campione di idrolisi.

Dati i PM (mg/mol) e la conversione da µL a mL, è necessario aggiungere 0,14 mg di IS a ciascun mL di campione iniziale.

2.1.6 Idrolisi acida in fase vapore

L’idrolisi in fase vapore è consigliata per campioni di proteine o peptidi relativamente puri contenenti poco o nessun materiale particolato. È considerato l’approccio più sensibile. Per questo tipo di idrolisi si preferisce una workstation di idrolisi automatizzata indipendente. Il controllo del vuoto, il mantenimento della temperatura, i lavaggi con azoto e l’asciugatura dei campioni richiesti nella procedura vengono eseguiti al meglio da un sistema automatizzato come la workstation di idrolisi Eldex descritta nella Sezione 4.

Reagenti:

• 6 N HCl con 1% in volume di fenolo
• Azoto (di grado pre-purificato)
• Ghiaccio secco

Nota: per ulteriori informazioni sui reagenti, consultare il manuale operativo della workstation di idrolisi.

Procedura (basata sull’utilizzo di una workstation automatizzata):

1. Asciugare un’aliquota contenente 0,5-20 µg di proteine in una provetta di idrolisi da 6 x 50 mm.
2. Aggiungere 200 µL di HCl a ebollizione costante contenente 0,5% di fenolo sul fondo del vial per vuoto (vedere il consiglio di seguito).
3. Sigillare il vial sotto vuoto dopo tre fasi alterne di lavaggio con azoto.
4. Idrolizzare a 112-116 °C per 24 ore.
5. Raffreddare il vial; rimuovere l’HCl in eccesso dall’esterno delle provette strofinando con un fazzoletto da laboratorio; asciugare sotto vuoto

Suggerimenti:

• Utilizzare fenolo cristallino e collocare un cristallo (≈0,5 mg) sul fondo del vial. Il cristallo è più pulito e più stabile del fenolo liquefatto.
• Pipettare con cautela il campione e lo standard interno sul fondo delle provette; utilizzare una siringa per garantire precisione e facilità di erogazione.
• È possibile etichettare le provette incidendole con una lima o con una matita a punta diamantata.
• Evitare che gocce di HCl si infiltrino nelle provette. Tenere le provette in posizione verticale nel vial per vuoto. Con meno di 10-12 provette, aggiungere provette vuote come supporto. Può essere utile inclinare leggermente il vial durante il raffreddamento.

Nota: dopo l’idrolisi è comune una colorazione bruna dell’HCl. Deriva dal fenolo. L’etanolo o l’acetone sono adatti a rimuovere lo scolorimento da vial e tappi.

ATTENZIONE: i problemi di idrolisi possono essere difficili da distinguere dai problemi di derivatizzazione.

2.1.7 Idrolisi acida in fase liquida

L’idrolisi in fase liquida viene utilizzata quando i campioni sono più complessi. In questo caso, sono presenti particelle o altri corpi estranei che possono interferire con il processo della fase vapore. Questo approccio è considerato nel complesso meno sensibile; ma, se eseguito con attenzione e precisione, può dare buoni risultati.

• Apparecchiatura e reagenti necessari per questa metodologia:
• Bilancia analitica
• Forno o blocco riscaldante in grado di mantenere la temperatura impostata ±0,1 °C
• Miscelatore vortex
• Pipette volumetriche
• Micropipette regolabili
• Provette per idrolisi con tappo, consigliate 6 x 50 mm
• Sorgente di azoto per il lavaggio
• 6 N HCl

Procedura:

Prima di iniziare -

Pesare i campioni corrispondenti a circa 20 mg di proteine con l’approssimazione di 0,1 mg in provette per idrolisi o trasferire il campione diluito nelle provette (come calcolato nelle sezioni 2.1.3 e 2.1.4). In genere si ottiene un volume totale di 10 µL. Miscelare.

1. Aggiungere esattamente il volume corretto di standard interno, calcolato dalla Sezione 2.1.5, nelle provette per idrolisi. Miscelare.
2. Aggiungere un eccesso di 6 N HCl (calcolato in base alla Sezione 2.1.4, passaggio 3), miscelare e spurgare con azoto per 30 s. Tappare subito.
3. Inserire nel forno a 110 °C per 24 ore. (Questi parametri dovrebbero essere il risultato di uno studio temporale per le proteine e gli amminoacidi di interesse.)
4. Togliere dal forno e lasciare raffreddare.
5. Il campione è pronto per passare alla fase di derivatizzazione.

2.1.8 Risoluzione dei problemi di idrolisi acida

Diversi amminoacidi sono influenzati da un’idrolisi inadeguata. Ad esempio:

• Rese basse di metionina (Met) e tirosina (Tyr) sono spesso il sintomo di una procedura di idrolisi poco accurata, con HCl impuro o una rimozione dell’ossigeno non adeguata. Entrambi i problemi possono portare alla formazione di cloro e alla successiva clorazione di Tyr.
• Rese basse di amminoacidi idrofobici (Ile, Leu, Val e altri) possono indicare un’idrolisi incompleta, causata dalla bassa temperatura del forno, un tempo di idrolisi ridotto (in particolare se si utilizza un’idrolisi rapida ad alta temperatura) o perdita di HCl derivante da un eccesso di evacuazione dopo lo spurgo con azoto (questo può essere un problema specifico del campione; alcune sequenze, come lle-Val-Leu, sono estremamente resistenti all’idrolisi). Verificare che l’HCl liquido rimanga visibile nel vial prima di inserirlo nel forno. Anche una quantità eccessiva di HCl può rappresentare un problema: se liquido può condensare nel campione e dare luogo a un residuo brunastro, alla perdita di Tyr e Met e alla comparsa di picchi isolati.
• Se non si utilizza una workstation per l’idrolisi in fase gassosa, assicurarsi che l’impostazione per l’idrolisi sia adeguata. L’intero vial di idrolisi deve essere incluso nel forno; l’utilizzo di un blocco riscaldante che racchiude solo la metà inferiore del vial causerà la condensazione di HCl liquido nella parte superiore e l’idrolisi sarà inefficace. 

L’analisi di Trp in proteine e peptidi è complicata dall’instabilità di questo amminoacido in condizioni normali di idrolisi con 6 N HCl. È possibile utilizzare procedure di idrolisi alternative per generare Trp intatto per l’analisi:

• Idrolisi acida solfonica (ad esempio, acido metansolfonico e p-toluensolfonico)
• Idrolisi alcalina e uso di reagenti tiolici in HCl, come il B-mercaptoetanolo (BME) o l’acido tioglicolico

2.2.1 Idrolisi dell’acido metansolfonico (MSA) per l’analisi del triptofano

Il reagente MSA deve essere aggiunto direttamente nelle provette per campioni da 6 x 50 mm (idrolisi in fase liquida), poiché l’acido non è volatile. L’aggiunta di metanolo e la neutralizzazione dopo l’idrolisi forniscono buoni risultati per il triptofano e non interferiscono in nessun successivo processo di derivatizzazione. La Figura 2 illustra la reazione dell’MSA con le proteine.

Nota: questa procedura può anche essere utilizzata per la determinazione di Cys e Met. Questa converte Cys in Cya e Met in metionina sulfossido.

Nota: Tyr e Trp non sono stabili nella procedura di ossidazione con acido performico tradizionalmente utilizzata per l’analisi di Cys e Met.

2.2.1.1 Apparecchiatura e reagenti

• MSA 4 M contenente 0,2% (p/v) di triptamina cloridrato
• Acqua ultrapura
• Metanolo-acqua-trietilammina, 2:2:1
• Provette per idrolisi 6 x 50 mm
• Apparecchio di asciugatura sotto vuoto
• Bagnomaria o blocco riscaldante

2.2.1.2 Procedura

1. Aggiungere 20 µL di 4 M MSA contenente triptamina cloridrato 0,2% (p/v) a ciascuna provetta con campione da 6 x 50 mm contenente campione essiccato.
2. Aggiungere 100 µL di acqua al vial di reazione.
3. Guarnizione per idrolisi.
4. Idrolizzare a 110 °C per 20-24 ore.
5. Raffreddare, aprire il vial e aggiungere 22 µL di KOH 4 M (abbastanza da neutralizzare) a ciascuna provetta.
6. Asciugare sotto vuoto.
7. Il campione è pronto per la derivatizzazione.

Suggerimenti:

Verificare la presenza di interferenze con i campioni di bianco di controllo.

• Utilizzare MSA nuovo e puro.
• È possibile che parte dell’interferenza che oscura occasionalmente Tyr o Val provenga dalla triptamina utilizzata come additivo nell’acido in commercio. L’uso di MSA senza l’additivo potrebbe essere una soluzione.
• Utilizzare KOH nuovo (o NaOH in sostituzione, se si ritiene più pulito per il laboratorio). Verificare la capacità della base di neutralizzare l’acido su un campione di prova. Aggiungere un volume di base tale da mantenere al minimo l’eccesso di base.
• Preparare uno standard Trp da 2,5 µmol/mL in H20. Mettere nel freezer. Miscelare lo standard Trp 1:1 con lo standard H per la calibrazione.

AVVERTENZA:

• Possono verificarsi interferenze con Tyr e Val. La causa è sconosciuta. (HCl è preferibile per l’idrolisi di Tyr.)
• Rese basse di Met sono una funzione delle condizioni di idrolisi.
• Le rese di Trp e Met non sono lineari a causa del processo di idrolisi, non della procedura di analisi. Man mano che la quantità di idrolizzato si riduce, le rese diminuiscono; con Met il risultato è più marcato.
• Scarsa riproducibilità dei risultati di Arg: causa sconosciuta.

2.2.2 Idrolisi alcalina per l’analisi del triptofano

Se l’idrolisi acida del triptofano solleva problemi di stabilità, un’altra alternativa è l’idrolisi alcalina delle proteine.

• NaOH
• Acido acetico
• Acqua ultrapura
• Provette per idrolisi 6 x 50 mm
• Apparecchio di asciugatura sotto vuoto
• Bagnomaria o blocco riscaldante

1. Può essere necessario l’uso di provette di plastica (ad esempio Teflon) per evitare la formazione di silicati e i successivi problemi di solubilizzazione o derivatizzazione.
2. Aggiungere 20 µL di NaOH 4 M nuovo direttamente nella provetta per idrolisi come nella procedura MSA descritta in precedenza.
3. Sigillare la provetta e riscaldarla a 112 °C per 16 ore.
4. Raffreddare e neutralizzare con acido acetico in eccesso.
5. Il campione è pronto per la derivatizzazione.
6. Analizzare i bianchi per determinare il livello di contaminazione.
7. Verificare il metodo su standard e campioni noti.

La quantificazione della cisteina (Cys) nei campioni proteici è complicata dall’instabilità di questo amminoacido in condizioni di idrolisi acida standard. Purtroppo, a differenza di Trp, idrolisi acide o alcaline alternative non sono soddisfacenti. Due procedure comuni per l’analisi di Cys comportano la conversione della cisteina in derivati più stabili. La prima procedura è l’alchilazione del gruppo sulfidrile e la seconda è un’ossidazione ai più stabili acido solfonico, cisteico o cianurico (Cya).

AVVERTENZA: un’ulteriore complicazione nell’analisi Cys è che gran parte dell’amminoacido è presente come dimero, la cistina (Cys2), che deve essere ridotta a cisteina prima di qualsiasi procedura di alchilazione.

È importante notare che queste procedure specifiche vengono eseguite prima della fase di idrolisi acida standard.

L’acido performico è un potente reagente ossidante che converte quantitativamente la cisteina (Cys) e la cistina (Cys2) in acido cisteico (Cya) (Figura 4). La letteratura contiene numerosi riferimenti all’uso di questo reagente in un’ampia varietà di condizioni e procedure. La seguente procedura si basa su quella di Tarr, G.E., 1986.

Nota: questa procedura fornisce i risultati più accurati per la cisteina e la metionina.

• Apparecchio di asciugatura sotto vuoto
• Provette per idrolisi da 6 x 50 mm con tappi
• Acido formico ultrapuro
• Perossido di idrogeno ultrapuro
• Bilancia analitica
• Micropipette

1. Asciugare il campione (0,1-10 µg di proteine o 50-2000 pmol di peptidi) sotto vuoto in una provetta di idrolisi da 6 x 50 mm.
2. Miscelare 19 volumi di acido formico al 97% con 1 volume di perossido di idrogeno; lasciare riposare un’ora a 22 °C.
3. Aggiungere 10 µL di questo reagente al campione essiccato, lasciare riposare per 30 minuti a 22 °C e asciugare sotto vuoto.
4. Idrolizzare utilizzando la procedura standard per 6 M HCl (vedere la sezione 1.1).

Nota: Tyr e Trp non sono stabili in questa procedura di ossidazione.

Le procedure di alchilazione sono più selettive dell’ossidazione con acido performico e comportano modifiche minime o nulle per gli altri amminoacidi. Ciò li rende più adatti all’analisi della proteina intera, così come ad altre procedure che possono seguire la modifica di Cys, come la mappatura dei peptidi.

In questo metodo, l’alchilazione è presentata con 4-vinilpiridina; la procedura generale descritta di seguito può essere adattata anche per diversi agenti alchilanti. In linea di principio, al campione deve essere aggiunto un reagente riducente sufficiente a convertire la cistina (Cys2) in cisteina (Cys). Questa è seguita da un’aggiunta di reagente alchilante in eccesso al campione ridotto (Figura 5).

• Essiccatore sotto vuoto, sorgente di asciugatura ad azoto o liofilizzatore
• Vial richiudibili
• Bilancia analitica
• pH-metro
• Micropipette
• Piridiletilcisteina (PEC) come standard
• Guanidinio HCl (Gu-HCl)
• Ditiotreitolo (DTT)
• 4-vinilpiridina (4-VP)
• N-etilmorfolinio acetato
• Acido acetico ultrapuro
• Standard per amminoacidi (codice: WAT088122)

1. Aggiungere acqua a 6,4 mL di N-etilmorfolinio per portare il volume a 100 mL.
2. Titolare a pH 8,3 con acido acetico.

La seguente procedura può essere utilizzata per 1-1000 nmol di proteine o peptidi.

1. Collocare il campione in un vial richiudibile; asciugare sotto vuoto, usare N₂ o la liofilizzazione.
2. Sciogliere il campione in 1 mL di tampone.
3. Aggiungere 1 g di Gu-HCl. Miscelare.
4. Aggiungere 4 mg di DDT. Miscelare.
5. Coprire il campione con N₂, sigillare ermeticamente e incubare a temperatura ambiente per 4 ore.
6. Aggiungere 8 µL di 4-VP, ricoprire con N₂, sigillare e incubare a temperatura ambiente per 4-16 ore.
7. Aggiungere 3 mL di acqua.
8. Dissalare.
9. Il campione può ora essere idrolizzato con acido.

Nota: il volume totale della reazione può essere regolato riducendo tampone a 0,25 mL, Gu-HCl a 250 mg, DTT a 1 mg e 4-VP a 2 µL. Questo è adeguato fino a 250 pmol di campione. Dopo l’alchilazione, diluire con 750 µL di H₂0 e procedere.

1. Preparare una soluzione di 2,5 mM di piridiletilcisteina (PEC).
2. Aggiungere 200 µL di standard per amminoacidi a 200 µL.
3. Derivatizzare 10 µL di miscela di calibrazione PEC combinata.
4. Ricostituire in 100 µL; iniettare 4 µL per calibrare a livello di 250 pmol.

Nota: 8 µL di 4-VP corrispondono a circa 74 µmol. La sostituzione del reagente alchilante 4-VP (ad esempio, acido iodoacetico) nella procedura può essere eseguita utilizzando la stessa concentrazione di reagente.