Guida alla Cromatografia Liquida per Principianti

Allumina

Forma particellare porosa di ossido di alluminio [Al₂0₃] utilizzata come fase stazionaria nella cromatografia di adsorbimento in fase diretta. L’allumina ha una superficie basica altamente attiva; il pH di una sospensione acquosa al 10% è di circa 10. Viene successivamente lavata con acido forte per ottenere gradi neutri e acidi [sospensioni rispettivamente di pH 7.5 e 4]. L’allumina è più igroscopica della silice. La sua attività è misurata secondo la scala di Brockmann† per il contenuto di acqua; per esempio, il grado di attività I contiene l’1% di H₂O.

†H. Brockmann e H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941).

Linea di Base*

Porzione del cromatogramma che registra la risposta del rivelatore quando dalla colonna esce solo la fase mobile.

Cartuccia

Tipo di colonna, priva di raccordi terminali, costituita semplicemente da un tubo aperto in cui il materiale di impaccamento è trattenuto da una fritta alle due estremità. Le cartucce SPE possono essere utilizzate in parallelo su un collettore per vuoto. Le cartucce HPLC sono posizionate in un supporto per cartucce dotato di collegamenti idraulici integrati in ciascuna estremità. Le colonne a cartuccia sono facili da sostituire, meno costose e più pratiche delle colonne tradizionali con raccordi terminali integrati.

Cromatogramma*

Rappresentazione grafica o di altro tipo della risposta del rivelatore o di un’altra quantità utilizzata come misura della concentrazione dell’analita nell’effluente in funzione del volume dell’effluente o del tempo. In cromatografia planare [per esempio, cromatografia su strato sottile o cromatografia su carta], cromatogramma può riferirsi alla carta o allo strato contenente le zone separate.

Cromatografia*

Metodo di separazione fisico-chimico dinamico in cui i componenti da separare sono distribuiti tra due fasi, una delle quali è stazionaria [la fase stazionaria] mentre l’altra [la fase mobile] si sposta rispetto alla fase stazionaria.

Volume della Colonna* [Vc]

Volume geometrico della parte del tubo che contiene l’impaccamento [area della sezione trasversale interna del tubo moltiplicata per la lunghezza del letto di impaccamento, L]. Il volume interparticellare della colonna, chiamato anche volume interstiziale, è il volume occupato dalla fase mobile tra le particelle nel letto impaccato. Il volume vuoto [V₀] è il volume totale occupato dalla fase mobile, ovvero la somma del volume interstiziale e del volume intraparticellare  [detto anche volume dei pori].

Rivelatore* [vedere Sensibilità]

Dispositivo che indica una modifica nella composizione dell’eluente misurando proprietà fisiche o chimiche [ad esempio, assorbanza della luce UV/visibile, indice di rifrazione differenziale, fluorescenza o conduttività]. Se la risposta del rivelatore è lineare rispetto alla concentrazione del campione, è possibile quantificare la quantità di un componente tramite opportuna calibrazione con standard. Spesso può essere utile utilizzare due diversi tipi di rivelatori in serie. In questo modo, è possibile ottenere informazioni più avvaloranti o specifiche sugli analiti del campione. Alcuni rivelatori [ad esempio elettrochimici, spettrometri di massa] sono distruttivi; in altre parole, effettuano un cambiamento chimico nei componenti del campione. Se un rivelatore di questo tipo è associato a un rivelatore non distruttivo, in genere viene posizionato per secondo nel circuito idraulico.

Display

Dispositivo che registra la risposta elettrica di un rivelatore sullo schermo di un computer sotto forma di cromatogramma. I sistemi avanzati di registrazione dei dati eseguono inoltre calcoli utilizzando algoritmi sofisticati, per esempio per integrare le aree dei picchi, sottrarre le linee di base, confrontare gli spettri, quantificare i componenti e identificare i componenti sconosciuti rispetto alle librerie standard.

Efficienza [H, vedere Numero di piastra, Risoluzione, Sensibilità, Velocità]

Misura della capacità di una colonna di resistere alla dispersione di una banda di campione mentre attraversa il letto impaccato. Una colonna efficiente riduce al minimo la dispersione di banda o l’allargamento di banda. Una maggiore efficienza è importante per una separazione efficace, una maggiore sensibilità e/o l’identificazione di componenti simili in una miscela di campioni complessa.

I premi Nobel Martin e Synge, per analogia con la distillazione, introdussero il concetto di altezza della piastra [H, o H.E.T.P., altezza equivalente a una piastra teorica] come misura dell’efficienza cromatografica e come mezzo per confrontare le prestazioni delle colonne.† Anticipando la tecnologia HPLC e UPLC, essi compresero che la chiave per la massima efficienza era un letto omogeneo impaccato con le dimensioni di particelle più piccole possibili [per cui è necessaria una pressione più elevata]. La relazione tra i parametri della colonna e del sistema di separazione che influiscono sull’allargamento di banda è stata successivamente descritta in un’equazione da van Deemter.††

I cromatografi definiscono spesso efficienza una quantità che possono calcolare facilmente e direttamente dalle misurazioni eseguite su un cromatogramma, vale a dire il numero di piastra [N]. L’altezza della piastra viene quindi determinata dal rapporto tra la lunghezza del letto della colonna e N [H = L/N; i metodi per calcolare N a partire da un cromatogramma sono illustrati nella Figura U]. È importante notare che il calcolo di N o H utilizzando questi metodi è corretto solo per le condizioni isocratiche e non può essere utilizzato per le separazioni in gradiente.

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg e A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 [1956]

Eluato

Porzione dell’eluente che fuoriesce dall’uscita della colonna contenente gli analiti in soluzione. Nell’HPLC analitica, l’eluato viene esaminato dal rivelatore per verificare la concentrazione o la massa degli analiti al suo interno. Nell’HPLC preparativa, l’eluato viene raccolto in modo continuo in aliquote a intervalli di tempo o di volume uniformi, oppure in modo discontinuo solo quando un rivelatore indica la presenza di un picco di interesse. Queste frazioni vengono successivamente processate per ottenere composti purificati.

Eluente

La fase mobile [vedere Cromatografia di eluizione].

Serie Eluotropica

Elenco di solventi ordinati per forza di eluizione con riferimento ad analiti specificati su un sorbente standard. Tale serie è utile quando si sviluppano metodi di eluizione sia isocratici che in gradiente. Trappe coniò questo termine dopo aver dimostrato che una sequenza di solventi di polarità crescente poteva separare le frazioni lipidiche sull’allumina.† In seguito, Snyder misurò e tabulò i parametri di forza dei solventi per un ampio elenco di solventi su diversi sorbenti LC in fase diretta.†† Neher creò un nomogramma molto utile tramite il quale era possibile scegliere miscele equi-eluotropiche [con forza di eluizione costante] di solventi in fase diretta per ottimizzare la selettività delle separazioni TLC.†††

Una tipica serie eluotropica in fase diretta inizia dall’estremità debole con idrocarburi alifatici non polari, per esempio pentano o esano, per poi progredire verso benzene [un idrocarburo aromatico], diclorometano [un idrocarburo clorato], dietil etere, etil acetato [un estere], acetone [un chetone] e, infine, metanolo [un alcol] all’estremità forte [vedere la Figura R-1].

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp. 192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp. 75–86.

Eluire*

Cromatografare mediante cromatografia di eluizione. Il processo di eluizione può essere interrotto mentre tutti i componenti del campione si trovano ancora sul letto cromatografico [cromatografia planare su strato sottile o su carta] o proseguito fino a quando i componenti hanno lasciato il letto cromatografico [cromatografia su colonna].

Nota: il termine eluire è preferito a sviluppare [un termine utilizzato in cromatografia planare], per evitare confusione con la pratica dello sviluppo di metodi, in base alla quale un sistema di separazione [la combinazione di fasi mobile e stazionaria] è ottimizzato per una particolare separazione.

Cromatografia di Eluizione*

Procedura per la separazione cromatografica in cui la fase mobile viene fatta passare continuamente attraverso il letto cromatografico. Nell’HPLC, una volta che la linea di base del rivelatore si è stabilizzata e il sistema di separazione ha raggiunto l’equilibrio, una porzione finita di campione viene introdotta nel flusso della fase mobile. L’eluizione continua finché tutti gli analiti di interesse sono passati attraverso il rivelatore.

Forza di Eluizione

Misura dell’affinità di un solvente rispetto a quella dell’analita per la fase stazionaria. Un solvente debole non può spostare l’analita, causando la forte ritenzione dello stesso sulla fase stazionaria. Un solvente forte può sostituire completamente tutte le molecole dell’analita e trasportarle attraverso la colonna non trattenute. Per ottenere un equilibrio adeguato tra separazione effettiva e volume di eluizione ragionevole, i solventi sono spesso miscelati in modo da creare un’adeguata concorrenza tra le fasi, ottimizzando così sia la selettività che il tempo di separazione per un determinato set di analiti [vedere Selettività].

Il momento di dipolo, la costante dielettrica, i legami idrogeno, le dimensioni e la forma molecolari e la tensione superficiale possono fornire qualche indicazione sulla forza di eluizione. La forza di eluizione è determinata anche dalla modalità di separazione. Una serie eluotropica di solventi può essere ordinata incrementando la forza in una direzione in condizioni di adsorbimento o di fase diretta; tale ordine può essere quasi opposto in condizioni di partizione in fase inversa [vedere la Figura R-1].

Fluorimetro

I fluorimetri eccitano un campione con una lunghezza d’onda della luce specificata. Ciò fa sì che alcuni composti emettano fluorescenza e luce a una lunghezza d’onda più elevata. Un sensore, impostato su una lunghezza d’onda di emissione specifica e mascherato in modo da non essere accecato dalla sorgente di eccitazione, raccoglie solo la luce emessa. Spesso gli analiti che non emettono fluorescenza in modo nativo possono essere derivatizzati per sfruttare l’elevata sensibilità e selettività di questa forma di rivelazione, per esempio la derivatizzazione AccQ•Tag degli amminoacidi.

Velocità di Flusso*

Volume della fase mobile che attraversa la colonna nell’unità di tempo. Nei sistemi HPLC la velocità di flusso viene impostata dal controller per il sistema di erogazione del solvente [pompa]. L’accuratezza della velocità di flusso può essere verificata tramite la raccolta temporizzata e la misurazione dell’effluente all’uscita della colonna. Poiché la densità di un solvente varia con la temperatura, qualsiasi calibrazione o misurazione della velocità di flusso deve tenere conto di questa variabile. Le determinazioni più accurate vengono eseguite, quando possibile, in base al peso, non al volume.

Uniformità [precisione] e riproducibilità della velocità di flusso sono importanti per molte tecniche LC, in particolare nelle separazioni in cui i tempi di ritenzione sono fondamentali per l’identificazione degli analiti o nella cromatografia a permeazione di gel in cui la calibrazione e la correlazione dei tempi di ritenzione sono fondamentali per misurazioni accurate della distribuzione del peso molecolare di polimeri.

Spesso le condizioni di separazione vengono confrontate in base alla velocità lineare, non alla velocità di flusso. La velocità lineare viene calcolata dividendo la velocità di flusso per l’area della sezione trasversale della colonna. Mentre la velocità di flusso è espressa in volume/tempo [per esempio, mL/min], la velocità lineare è misurata in lunghezza/tempo [per esempio, mm/s].

Cromatografia a Permeazione di Gel*

Separazione basata principalmente sugli effetti di esclusione dovuti a differenze di dimensione e/o forma molecolare. La cromatografia a permeazione di gel e la cromatografia a filtrazione su gel descrivono il processo quando la fase stazionaria è un gel rigonfio. Entrambe sono forme di cromatografia in size exclusion. Porath e Flodin descrissero per primi la gel-filtrazione utilizzando gel di destrano e fasi mobili acquose per la separazione di biomolecole basata sulle dimensioni.† Moore applicò principi simili alla separazione per dimensione di polimeri organici in soluzione utilizzando fasi mobili di solventi organici su gel di polimero di polistirene-divinilbenzene poroso.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore, U.S. Patent 3,326,875 [filed Jan. 1963; issued June 1967]

Gradiente

Variazione nel tempo delle concentrazioni relative di due [o più] componenti di solvente miscibili che formano una fase mobile con forza di eluizione crescente. Nell’estrazione in fase solida viene in genere utilizzato un gradiente a gradini; in ogni passaggio, la composizione dell’eluente viene modificata bruscamente da una fase mobile più debole a una fase mobile più forte. È anche possibile, asciugando il letto di sorbente per SPE tra un gradino e l’altro, passare da un solvente a un altro solvente immiscibile.

Un gradiente continuo è solitamente generato da un sistema di miscelazione a bassa o ad alta pressione [vedere le figure J-2 e J-3] secondo una curva predeterminata [lineare o non lineare] che rappresenta la concentrazione del solvente più forte B nel solvente iniziale A in un periodo di tempo fisso. È possibile programmare un mantenimento a composizione isocratica fissa del solvente in qualsiasi momento all’interno di un gradiente continuo. Al termine di una separazione, è anche possibile impostare il programma del gradiente in modo da tornare alla composizione iniziale della fase mobile per riequilibrare la colonna in preparazione all’iniezione del campione successivo. I sofisticati sistemi HPLC possono miscelare fino a quattro o più solventi [o miscele di solventi] in un gradiente continuo.

Iniettore [Campionatore Automatico, Sistema di Gestione Campioni]

Meccanismo per introdurre in modo accurato e preciso [iniettare] un volume separato e predeterminato di una soluzione di campione nel flusso della fase mobile. L’iniettore può essere un semplice dispositivo manuale o un sofisticato campionatore automatico che può essere programmato per iniezioni non monitorate di molti campioni da una serie di singoli vial o pozzetti in una sequenza predeterminata. I vani campioni in questi sistemi possono anche essere dotati di controllo della temperatura per mantenere l’integrità del campione per molte ore di funzionamento.

La maggior parte degli iniettori moderni include un loop del campione riempito con siringa che può essere attivato o disattivato tramite una valvola a più porte. Un sistema di iniezione ben progettato e a volume interno minimo è posizionato il più vicino possibile all’ingresso della colonna e riduce al minimo l’allargamento della banda del campione. Tra un’iniezione di campione e l’altra può anche essere smaltito come scarico dalla fase mobile, o da un solvente di lavaggio, per prevenire il carryover [contaminazione del campione presente da parte di un campione precedente].

Se possibile, preparare al meglio i campioni per l’iniezione dissolvendoli nella fase mobile nella quale verranno iniettati; in questo modo è possibile evitare problemi di separazione e/o rivelazione. Se deve essere utilizzato un altro solvente, è opportuno che la sua forza di eluizione sia pari o inferiore a quella della fase mobile. È spesso opportuno miscelare una parte della soluzione del campione con la fase mobile fuori linea per verificare la presenza di problemi di precipitazione o di miscibilità che potrebbero compromettere la riuscita della separazione.

Sistema di Introduzione Campioni

L’estremità del letto della colonna da cui entrano il flusso della fase mobile e il campione. Una fritta porosa inerte trattiene il materiale di impaccamento e protegge il sistema di introduzione campioni del letto del sorbente da un’eventuale contaminazione del particolato. La buona prassi HPLC prevede che i campioni e le fasi mobili siano privi di particolato; questo diventa fondamentale per le colonne a piccole particelle i cui sistemi di introduzione campioni sono molto più facilmente ostruibili. Se il sistema di introduzione campioni del letto della colonna si ostruisce e presenta una contro-pressione superiore al normale, a volte, invertendo la direzione del flusso mentre si dirige l’effluente verso lo scarico è possibile rimuovere ed eliminare i residui del campione che si trovano sulla parte superiore della fritta. Se i residui sono penetrati nella fritta e si sono depositati sull’estremità del sistema di introduzione campioni del letto, molto probabilmente la colonna ha raggiunto il termine della sua durata.

Cromatografia a Scambio Ionico* [vedere la sezione: Separazioni Basate sulla Carica]

Questa modalità di separazione si basa principalmente sulle differenze nelle affinità di scambio ionico dei componenti del campione. La separazione di specie ioniche principalmente inorganiche in acqua o in fasi mobili acquose tamponate su colonne a scambio ionico ad alta efficienza, superficialmente porose, per particelle di piccole dimensioni, seguita da rivelazione conduttometrica o elettrochimica è denominata cromatografia ionica [IC].

Eluizione Isocratica*

Procedura in cui la composizione della fase mobile rimane costante durante il processo di eluizione.

Cromatografia Liquida* [LC]

Tecnica di separazione in cui la fase mobile è un liquido. La cromatografia liquida può essere eseguita in una colonna o su un piano [TLC o cromatografia su carta]. Nel 1970, la moderna cromatografia liquida che utilizzava particelle più piccole e una pressione di ingresso più elevata venne definita cromatografia liquida ad alte prestazioni (o ad alta pressione) e indicata con l’acronimo HPLC. Nel 2004, la cromatografia liquida a prestazioni ultra alte ha aumentato notevolmente le prestazioni della tecnologia LC a un nuovo livello [vedere Tecnologia UPLC].

Fase Mobile* [vedere Eluato, Eluente]

Fluido che percola, in una direzione definita, attraverso la lunghezza del letto sorbente di fase stazionaria. La fase mobile può essere un liquido [cromatografia liquida] o un gas [gascromatografia] o un fluido supercritico [cromatografia a fluido supercritico]. In gascromatografia, l’espressione gas di trasporto può essere utilizzata per la fase mobile. Nella cromatografia di eluizione, la fase mobile può anche essere denominata eluente, mentre il termine eluato è definito come la porzione della fase mobile che è passata attraverso il letto sorbente e contiene i composti di interesse in soluzione.

Cromatografia in Fase Diretta

Procedura di eluizione in cui la fase stazionaria è più polare della fase mobile. Questo termine viene utilizzato in cromatografia liquida per enfatizzare il contrasto con la cromatografia in fase inversa.

Picco* [vedere Numero di piastra]

Porzione di un cromatogramma differenziale che registra la risposta del rivelatore durante l’eluizione di un singolo componente dalla colonna. Se la separazione è incompleta, due o più componenti possono essere eluiti come un picco irrisolto. I picchi eluiti in condizioni ottimali da una colonna ben impaccata ed efficiente, utilizzata in un sistema che riduce al minimo l’allargamento di banda, si avvicinano alla forma di una distribuzione gaussiana. La quantificazione viene in genere eseguita misurando l’area del picco [racchiusa tra la linea di base e la curva del picco]. Meno spesso, per la quantificazione è possibile utilizzare l’altezza del picco [la distanza misurata dall’apice del picco alla linea di base]. Questa procedura richiede che sia l’ampiezza che la forma del picco rimangano costanti.

Numero di Piastra* [N, vedere Efficienza]

Un numero che indica le prestazioni della colonna [potenza o efficienza di separazione meccanica, noto anche come piatti teorici, numero di piastre teoriche o numero teorico di piastre]. Mette in relazione l’entità della ritenzione di un picco con la sua ampiezza [varianza o allargamento di banda]. Per calcolare i piatti teorici, si presuppone che un picco possa essere rappresentato da una distribuzione gaussiana [una curva a campana statistica]. In corrispondenza dei punti di flesso [60,7% dell’altezza del picco], l’ampiezza di una curva gaussiana è il doppio della deviazione standard [σ] rispetto alla sua media [situata all’apice del picco]. Come mostrato nella Figura U, l’ampiezza del picco di una curva gaussiana misurata in corrispondenza di altre frazioni dell’altezza del picco può essere espressa in multipli di σ definiti con precisione. La ritenzione del picco [volume di ritenzione, V_R o tempo di ritenzione, t_R] e l’ampiezza del picco devono essere espresse nelle stesse unità, poiché N è un numero adimensionale. Si noti che il metodo 5 sigma per il calcolo di N è una misura più rigorosa dell’omogeneità e delle prestazioni della colonna, in quanto è più gravemente influenzata dall’asimmetria dei picchi. Le stazioni di elaborazione dati dei computer possono delineare automaticamente ciascun picco risolto e calcolare il numero di piastra corrispondente.

Cromatografia Preparativa

Processo di utilizzo della cromatografia liquida per isolare un composto in quantità e purezza sufficienti per ulteriori esperimenti o utilizzi. Per i processi di purificazione farmaceutici o biotecnologici, è possibile utilizzare colonne di diversi piedi di diametro per più chilogrammi di materiale. Per isolare solo pochi microgrammi di un prodotto naturale di valore, è sufficiente una colonna analitica HPLC. Entrambi sono approcci cromatografici preparativi, che differiscono solo per la scala [vedere la sezione relativa alla Scala HPLC e la Tabella A].

Risoluzione* [Rs, vedere Selettività]

Separazione di due picchi espressa come la differenza dei rispettivi tempi di ritenzione divisa per l’ampiezza media dei picchi alla linea di base. R_s = 1,25 indica che due picchi di uguale ampiezza sono separati solo sulla linea di base. Quando R_s = 0,6, l’unica indicazione visiva della presenza di due picchi su un cromatogramma è una piccola tacca in prossimità dell’apice del picco. Le colonne a maggiore efficienza producono picchi più stretti e migliorano la risoluzione per separazioni difficili; tuttavia, la risoluzione aumenta solo della radice quadrata di N. Il metodo più efficace per incrementare la risoluzione consiste nell’aumentare la selettività modificando la combinazione di fase mobile/stazionaria utilizzata per la separazione cromatografica [vedere la sezione Potenza di Separazione Chimica].

Fattore di Ritenzione* [k]

Misura del tempo in cui il componente del campione rimane nella fase stazionaria rispetto al tempo in cui resta nella fase mobile; esprime il tempo di ritardo di un componente del campione da parte della fase stazionaria rispetto a quello necessario per percorrere la colonna con la velocità della fase mobile. Dal punto di vista matematico, è il rapporto tra il tempo di ritenzione [volume] regolato e il tempo di hold-up [volume]: k = t_R’/t_M [vedere Tempo di Ritenzione e Selettività].

Nota: in passato, questo termine è stato espresso anche come rapporto di partizione, rapporto di capacità, fattore di capacità o rapporto di distribuzione di massa e veniva indicato con il simbolo k’.

Tempo di Ritenzione* [tR]

Tempo che intercorre tra l’inizio dell’eluizione [in genere, nell’HPLC, il momento dell’iniezione o dell’introduzione del campione] e l’emergere del picco massimo. Il tempo di ritenzione regolato, t_R’, viene calcolato sottraendo da t_R il tempo di hold-up [t_M, il tempo dall’iniezione all’eluizione del picco massimo di un analita completamente non trattenuto].

Cromatografia in fase inversa*

Procedura di eluizione utilizzata nella cromatografia liquida in cui la fase mobile è significativamente più polare della fase stazionaria, per esempio un materiale microporoso a base di silice con catene alchiliche legate chimicamente alla superficie accessibile. Nota: evitare il termine errato fase invertita. [Vedere il riferimento 4 per alcune idee innovative sul meccanismo delle separazioni in fase inversa.]

Selettività [Fattore di separazione, σ]

Termine utilizzato per descrivere l’entità della differenza tra le affinità termodinamiche relative di una coppia di analiti per le fasi mobile e stazionaria specificate che compongono il sistema di separazione. Il termine corretto è fattore di separazione [σ]. È pari al rapporto dei fattori di ritenzione, k2/k1 [vedere Fattore di Ritenzione]; per definizione, σ è sempre ≥ 1. Se σ = 1, entrambi i picchi coeluiscono e non si ottiene alcuna separazione. Nella cromatografia preparativa è importante massimizzare α per ottenere la massima capacità di caricamento e produttività del campione. [vedere la sezione sulla Potenza di Separazione Chimica]

Sensibilità* [S]

Segnale in uscita per unità di concentrazione o unità di massa di una sostanza nella fase mobile che entra nel rivelatore, per esempio la pendenza di una curva di calibrazione lineare [vedere Rivelatore]. Per i rivelatori sensibili alla concentrazione [per esempio, assorbanza UV/VIS], la sensibilità è il rapporto tra altezza del picco e concentrazione dell’analita nel picco. Per i rivelatori sensibili al flusso di massa, è il rapporto tra altezza del picco e massa unitaria. Se la sensibilità deve essere una caratteristica prestazionale univoca, questa deve dipendere solo dal processo di misurazione chimica, non dai fattori di scala.

La capacità di rivelare [qualificare] o misurare [quantificare] un analita è governata da molti fattori strumentali e chimici. L’ideale sono picchi ben risolti [massima selettività] eluiti da colonne ad alta efficienza [ampiezza del picco stretta con buona simmetria per la massima altezza del picco], nonché una buona sensibilità e specificità del rivelatore. Per ottenere la massima sensibilità, anche l’interferenza del sistema di separazione e il rumore dei componenti elettronici devono essere ridotti al minimo.

Estrazione in Fase Solida [SPE]

Tecnica di preparazione del campione che utilizza i principi della LC per isolare, arricchire e/o purificare analiti da una matrice complessa applicata a un letto cromatografico in miniatura. La SPE fuori linea viene eseguita [manualmente o tramite automazione] con particelle più grandi in cartucce di plastica singole o in pozzetti della piastra di microeluizione, utilizzando una bassa pressione positiva o il vuoto per favorire il flusso. La SPE in linea viene eseguita con particelle più piccole in colonne HPLC in miniatura, utilizzando pressioni più elevate e una valvola per commutare la colonna SPE in linea con la colonna HPLC primaria o fuori linea verso lo scarico, a seconda dei casi.

I metodi SPE utilizzano gradienti a gradini [vedere Gradiente] per eseguire i passaggi di condizionamento del letto, caricamento dei campioni, lavaggio ed eluizione. I campioni vengono caricati in genere in condizioni in cui il valore k di analiti importanti è il più alto possibile, in modo che vengano trattenuti completamente durante i passaggi di caricamento e lavaggio. L’eluizione viene quindi eseguita passando a una miscela di solventi molto più forte [vedere Forza di Eluizione]. L’obiettivo è rimuovere le interferenze dovute alla matrice e isolare l’analita in soluzione e a concentrazione adeguata per le analisi successive.

Velocità [vedere Efficienza, Velocità di Flusso, Risoluzione]

Un vantaggio derivante dall’utilizzo di separazioni LC a velocità lineari più elevate utilizzando colonne analitiche a volume inferiore e a particelle più piccole o colonne preparative a volume maggiore e a particelle più grandi. Progressi nell’ordine di grandezza nella velocità della LC furono ottenuti nel 1972 [con l’uso di particelle da 10 μm e pompe in grado di fornire un flusso accurato di fase mobile a 6000 psi], nel 1976 [con colonne preparative da 75 μm utilizzate a una velocità di flusso di 500 mL/min], e nel 2004 [con l’introduzione della tecnologia UPLC, in cui colonne con particelle da 1,7 μm funzionavano a 15 000 psi].†

I sistemi LC analitici ad alta velocità non devono solo sopportare pressioni più elevate in tutto il sistema idraulico; il tempo di ciclo dell’iniettore deve essere breve; i miscelatori a gradiente devono essere in grado di alternare rapidamente i campioni; i sensori del rivelatore devono rispondere rapidamente a variazioni minime nella composizione dell’eluato; i sistemi di elaborazione dati devono raccogliere le dozzine di punti al secondo necessari per tracciare e quantificare accuratamente i picchi stretti.

Complessivamente, risoluzione, velocità ed efficienza più elevate garantiscono in genere una produttività maggiore. È possibile analizzare più campioni in una giornata lavorativa. È possibile purificare quantità maggiori di composto per analisi o per periodo di processo.

Fase Stazionaria*

Una delle due fasi che formano un sistema cromatografico. Può essere un solido, un gel o un liquido. Se liquido, può distribuirsi su un solido. Questo solido può contribuire al processo di separazione, ma può anche non contribuire affatto. Il liquido può anche essere legato chimicamente al solido [fase legata] o immobilizzato su di esso [fase immobilizzata].

L’espressione letto cromatografico o sorbente può essere utilizzata come termine generale per indicare una qualsiasi delle diverse forme in cui viene utilizzata la fase stazionaria.

L’uso del termine fase liquida per indicare la fase mobile in LC è sconsigliato. In questo modo si evita confusione con la gascromatografia, in cui la fase stazionaria è denominata fase liquida [il più delle volte si tratta di un liquido rivestito su un supporto solido].

La cromatografia di partizione liquido-liquido [LLC] in colonna aperta non si è trasformata in HPLC. È stata sostituita dall’uso di impaccamenti in fase legata. La LLC si è rivelata incompatibile con i rivelatori moderni a causa dei problemi di spurgo dal supporto solido del rivestimento liquido della fase stazionaria, che provocava in tal modo la contaminazione della fase mobile liquida immiscibile.

Tecnologia UPLC

L’utilizzo di un sistema LC ad alta efficienza progettato in modo olistico per contenere particelle di dimensioni inferiori a 2 μm e a una pressione operativa molto elevata è definito cromatografia liquida a prestazioni ultra alte [tecnologia UPLC].† I principali vantaggi di questa tecnologia sono miglioramenti significativi nella risoluzione rispetto all’HPLC e/o tempi di analisi più rapidi mantenendo la risoluzione osservata in una separazione HPLC esistente.

†Per ulteriori informazioni, visitare il sito: https://www.waters.com/uplc