Guida alla Cromatografia Convergente per Principianti

Dato l’ampio intervallo di selettività della cromatografia convergente descritto in precedenza, la tecnica è adatta per un’ampia gamma di applicazioni (Tabella 5).

Indipendentemente dall’area di mercato o dall’esatta natura degli analiti testati, la CC consente di superare i problemi analitici in tre modi principali:

• La cromatografia convergente semplifica il workflow
• La cromatografia convergente separa i composti con similarità strutturale
• La cromatografia convergente è una modalità di separazione ortogonale rispetto all’LC in fase inversa

Successivamente illustreremo i principali vantaggi della CC mediante alcuni esempi applicativi.

Una delle scoperte più utili avvenute durante l’evoluzione dall’SFC alla CC è la modalità di miscelazione della CO₂ compressa con un’ampia gamma di solventi organici per condurre analisi cromatografiche in un modo prima impossibile. In questa sezione spiegheremo il modo in cui la CC può semplificare drasticamente il workflow di un laboratorio di chimica analitica.

La semplificazione di un workflow, dalla raccolta iniziale dei campioni fino all’analisi finale, in genere ha il maggiore impatto sull’attività di qualsiasi laboratorio di chimica analitica. La CC è in grado di semplificare notevolmente il workflow per molte applicazioni, con conseguente risparmio di tempo e denaro, riduzione del rischio di errore e incremento della produttività. Alcune di queste semplificazioni includono:

• Combinazione di più tecniche (LC e GC)
• Combinazione di più metodi (LC in fase normale e LC in fase inversa)
• Riduzione dei tempi di preparazione dei campioni

Combinazione di Più Tecniche - Analisi dei Lipidi

L’analisi dei lipidi è importante per molti motivi. Nell’industria farmaceutica i profili lipidici sono studiati per determinare l’impatto dell’efficacia dei farmaci nei soggetti di controllo e in quelli trattati.

Nella ricerca clinica i livelli lipidici sono studiati come biomarker in diverse malattie, oltre che per l’efficacia del trattamento. Nelle applicazioni alimentari, alcune classi di lipidi, come i trigliceridi, vengono profilate a scopo nutrizionale o per determinare l’autenticità del prodotto. Nei materiali chimici, gli acidi grassi e i trigliceridi vengono analizzati nei prodotti petroliferi (per esempio il biodiesel). A seconda del risultato desiderato, l’analisi dei lipidi richiede tecniche diverse. Per gli acidi grassi liberi in genere si tratta della GC e richiede la derivatizzazione dell’acido grasso libero in estere metilico di acidi grassi (FAME) al fine di migliorare la forma del picco e i limiti di rivelazione, in particolare per le catene di carbonio più lunghe. La derivatizzazione può richiedere diverse ore e l’analisi GC risultante può richiedere fino a 30 minuti. I lipidi più polari, come i fosfolipidi e gli sfingolipidi, spesso richiedono l’HILIC o l’LC in fase normale per separare le diverse classi di lipidi (in base alla natura del gruppo di testa polare). Quindi, l’LC in fase inversa viene utilizzata per puntare ai lipidi più idrofobici all’interno di una classe in base alla lunghezza della catena del carbonio e/o al numero di doppi legami. Come si può notare, una caratterizzazione lipidica completa richiede più tecniche. Non è il caso della CC, che separa tutte le classi di lipidi con una singola iniezione. La Figura 40 mostra il profilo lipidico completo di un estratto di cuore di topo utilizzando il sistema ACQUITY UPC². In questo esempio, una colonna BEH e un gradiente generico separano le diverse classi di lipidi, ottenendo una separazione simile a quella fornita dall’LC in fase normale o dall’HILIC.

Per i lipidi neutri (cioè triacilglicerolo (TG), diacilglicerolo (DG), esteri del colesterolo (CE) e acidi grassi liberi), la semplice modifica delle condizioni della colonna e del gradiente mantiene e separa i diversi lipidi all’interno di ciascuna classe in base alla lunghezza della catena degli acidi grassi e al numero di doppi legami (Figura 41).

La CC non solo è più veloce della GC (fino a 10 volte più veloce) per questa applicazione, ma non è necessaria nessuna derivatizzazione, semplificando quindi notevolmente il workflow complessivo per l’analisi dei lipidi. L’assenza di derivatizzazione consente di risparmiare tempo e riduce al minimo errori potenziali quando si aggiungono questi step aggiuntivi nel workflow. Senza la CC, questo tipo di caratterizzazione e analisi mirata può richiedere fino a tre tecniche diverse, con conseguente riduzione della produttività dei campioni, maggior utilizzo di solventi, tempi di analisi più lunghi e incremento dei costi complessivi dell’analisi.

Combinazione di Più Metodi LC - Vitamine Liposolubili

L’analisi delle vitamine liposolubili è importante per l’industria farmaceutica, della diagnostica e della ricerca clinica, nonché per l’industria alimentare e dei combustibili. L’analisi delle vitamine liposolubili e dei carotenoidi in genere viene eseguita tramite LC in fase normale o in fase inversa (Tabella 6). A causa della difficoltà di separare questi composti in una singola iniezione, vengono analizzati singolarmente utilizzando colonne e fasi mobili diverse, con tempi di analisi compresi tra 10 e 30 minuti. Confronto con la CC, che analizza tutte le vitamine e i composti correlati in meno di 10 minuti (Figura 42). A differenza dei metodi di analisi tradizionali elencati nella Tabella 6, il metodo CC ottimizzato prevede l’utilizzo di una colonna singola, una condizione di fase mobile e di un rivelatore. Con la CC i solventi vengono iniettati direttamente, spesso utilizzando gli stessi impiegati per estrarre o dissolvere questi composti (cioè l’iso-ottano e l’esano) e non è necessario lo scambio di solventi in genere richiesto per l’analisi in fase inversa.

Riduzione dei Tempi di Preparazione dei Campioni

Oltre a separare più rapidamente gli analiti grazie alla possibilità di combinare più tecniche e metodi in un’unica soluzione, spesso la CC può ridurre il tempo di preparazione dei campioni. La compatibilità della CC con i solventi organici offre i seguenti vantaggi:

• Eliminazione degli step di idrolisi e/o derivatizzazione
• Eliminazione dell’evaporazione e ricostituzione per lo scambio dei solventi
• Riduzione del numero di step di manipolazione, riducendo così l’errore sperimentale e migliorando la qualità dei dati 

Per esempio, prendere in considerazione i molteplici step della preparazione dei campioni e le analisi necessarie per le vitamine liposolubili negli alimenti. La Figura 43 mostra un tipico workflow dei campioni per l’analisi delle vitamine A, D ed E negli alimenti. Da notare che le vitamine A ed E richiedono una procedura di preparazione dei campioni diversa rispetto alla vitamina D. Inoltre, sono necessarie tre analisi HPLC separate (sia in fase diretta che in fase inversa) per ciascuna vitamina. La preparazione dei campioni per l’analisi della vitamina D è particolarmente complessa e può comportare molti step, includendo in alcuni casi un passaggio HPLC semi-preparativo.

La procedura di preparazione dei campioni per l’analisi delle stesse vitamine utilizzando la CC è molto più semplice (Figura 44) grazie alla compatibilità della tecnica con i solventi organici non polari utilizzati nelle prime fasi del processo di estrazione. Nell’esempio, iniettando il campione direttamente dall’estrazione dell’esano, è possibile quantificare la vitamina E. Viene quindi concentrato per l’analisi delle vitamine A e D3, rendendo il tempo di analisi venti volte più rapido rispetto ai metodi di analisi tradizionali. Inoltre, la CC richiede solo tre step di preparazione dei campioni, un metodo e un singolo strumento, mentre il workflow tradizionale mostrato nella Figura 43 richiede 12 step di preparazione dei campioni e tre metodi su due strumenti diversi. Nella Tabella 7 sono riepilogati i vantaggi della CC per le applicazioni esaminate, evidenziandone altre per le quali gli analisti trarrebbero vantaggio da una semplificazione analoga.

Separazione Rapida di Composti Strutturalmente Simili

A volte gli isomeri e gli omologhi strutturali sono difficili da separare a causa della somiglianza strutturale, in particolare per gli isomeri ottici. Ora parleremo dell’uso della CC per i seguenti composti strutturalmente simili:

• Separazioni chirali (enantiomeri e diastereomeri)
• Isomeri di posizione (diversi nella posizione dei gruppi funzionali)
• Omologhi strutturali
  • Biomarker (coniugati/non coniugati)
  • Farmaci (metaboliti, impurezze, sostanze di degradazione)

Spesso i vari enantiomeri di un composto possono avere profili di potenza e tossicità variabili e, pertanto, devono essere monitorati durante le fasi di ricerca, sviluppo e produzione. Le separazioni chirali vengono eseguite principalmente mediante LC in fase normale utilizzando fasi stazionarie a base di cellulosa o amilosio. Nell’LC in fase normale, le separazioni in gradiente non sono facili da eseguire. Richiedono analisi isocratiche diverse su colonne diverse, con diverse combinazioni di fasi mobili e spesso con solventi altamente tossici. Il processo di sviluppo del metodo può richiedere molto tempo. Con la CC, la capacità di analizzare gradienti e coprire un ampio spazio di selettività con solventi non tossici consente agli analisti di sviluppare separazioni chirali in un solo giorno.

Da molti anni gli utenti di laboratorio di chimica della purificazione riconoscono il valore dell’SFC per questo tipo di separazione. Le separazioni analitiche SFC, sebbene difficili da eseguire, sono altamente desiderabili per lo screening chirale rapido, lo sviluppo di metodi chirali, la determinazione dell’eccesso enantiomerico e gli studi di inversione chirale. A differenza dell’LC in fase normale, la CC è altamente compatibile con la rivelazione per spettrometria di massa, in quanto consente di identificare e caratterizzare gli enantiomeri e la loro formazione durante le reazioni, le procedure operative di produzione e nei sistemi biologici (Figura 45).

La Figura 46 mette a confronto la cromatografia convergente e in fase diretta per la separazione degli enantiomeri del warfarin. La linea di base della CC risolve gli enantiomeri in una frazione del tempo rispetto alla fase diretta (fino a 30 volte più velocemente). Inoltre, l’eliminazione dei solventi tossici, che sono costosi sia da acquistare che da smaltire, riduce il costo delle separazioni chirali fino a 100 volte per ciascuna analisi. Tutti questi vantaggi rendono la CC la tecnica preferita per le analisi chirali di qualsiasi tipo.

Isomeri di Posizione e Omologhi Strutturali

La CC è utile per separare gli isomeri di posizione e altri omologhi strutturali. Gli isomeri di posizione sono composti con lo stesso peso molecolare (isobarico), ma differiscono per la posizione dei relativi gruppi funzionali. Si trovano spesso in applicazioni che comportano l’analisi dei materiali di partenza, il monitoraggio delle reazioni e la catalisi asimmetrica. Spesso questi composti vengono derivatizzati prima dell’analisi GC per facilitare la separazione degli isomeri. I metodi dell’LC in fase normale sono intrinsecamente meno robusti e più lenti. D’altra parte, la selettività delle separazioni CC separa facilmente gli isomeri di posizione senza derivatizzazione in un insieme generico di condizioni.

Il sistema ACQUITY UPC² (Figura 47) separa gli isomeri così rapidamente da poter valutare in tempo reale l’ottimizzazione dei materiali di partenza delle reazioni, degli intermedi e dei prodotti finali. Gli omologhi strutturali sono difficili da separare a causa della loro somiglianza e possono includere biomarker coniugati o non coniugati (per esempio glucuronidi, solfati), nonché metaboliti, sostanze di degradazione e impurezze di composti farmaceutici. Gli steroidi rappresentano una delle classi più popolari di omologhi strutturali (Figura 48). La somiglianza strutturale tra i diversi steroidi rende difficile la separazione e l’analisi, anche quando si utilizza la rivelazione MS, a causa delle piccole differenze di massa. La loro risoluzione è semplice con la CC utilizzando un gradiente di screening generico su più colonne in meno di due minuti (Figura 49). Questa separazione è complessa per l’LC in fase inversa a causa della natura non polare dei composti, mentre la GC richiede la derivatizzazione per migliorare la forma del picco e i limiti di rivelazione. L’accoppiamento del sistema ACQUITY UPC² con la rivelazione MS è un metodo valido per identificare e quantificare gli steroidi.

Gli omologhi strutturali coniugati sono più difficili da separare. Gli steroidi liberi (Figura 48) sono insolubili in acqua, pertanto l’organismo li converte in derivati idrosolubili trasformandoli nella loro forma solfatata. Questo processo produce un gruppo laterale idrofilo a carica negativa, che li rende idrosolubili (Figura 50). Isolati da fonti naturali per uso terapeutico, questi composti sono utilizzati come biomarker per studiare le malattie e determinare l’efficacia del trattamento. L’analisi di questi composti presenta due problemi principali.

In primo luogo, sono necessarie 2,5 ore per preparare un campione per un’analisi GC di 30 minuti che richiede l’idrolisi enzimatica del gruppo solfato seguita da derivatizzazione. In secondo luogo, la spettrometria di massa non è in grado di distinguere alcuni di questi estrogeni poiché sono isobarici (stesso m/z). Pertanto è necessaria la cromatografia per separare le diverse forme dei composti isobarici.

Con la CC, tutti i 10 estrogeni solfatati possono essere separati in 15 minuti (Figura 51), inclusi due picchi a eluizione ravvicinata (picchi 6 e 7) che non possono essere separati facilmente da un’analisi GC di 30 minuti (Figura 52). Con la CC, non è necessario idrolizzare e derivatizzare il campione perché i composti solfatati possono essere analizzati nella loro forma nativa. In questo modo si riduce significativamente la quantità di step necessari per analizzare le formulazioni terapeutiche, incrementando così il rendimento e la produttività.

Nella Tabella 8 sono riepilogati i vantaggi dell’utilizzo della CC per le applicazioni indicate in precedenza ed evidenziate altre aree applicative per la separazione di enantiomeri, isomeri di posizione e omologhi strutturali.

Ortogonalità

Le modalità di separazione ortogonali sono complementari l’una all’altra, ma sono uniche nel modo in cui trattengono i picchi in modo diverso e, così facendo, generano più informazioni su un campione rispetto a una sola modalità di separazione. La capacità di risolvere gli analiti utilizzando tecniche diverse è estremamente importante per i seguenti motivi:

• Sicurezza nell’identificazione e nella caratterizzazione di un’impurezza, di un picco di degradazione o di un composto simile (per esempio, composti isobarici o composti di coeluizione)
• Garanzia della caratterizzazione completa di un campione
• Possibilità di ottenere maggiori informazioni su un campione
• Separazione dei composti desiderati dalle interferenze della matrice

Esempi di tecniche di separazione ortogonale includono modalità complementari come la cromatografia in fase diretta e inversa. La selettività della CC è simile a quella della cromatografia in fase diretta, ma è molto più robusta, affidabile (vedere il capitolo 2) e riproducibile rispetto a qualsiasi metodo in fase diretta. Nella sezione seguente sono mostrati esempi di come utilizzare la CC come modalità di separazione ortogonale per raggiungere gli obiettivi sopra elencati.

La separazione di un principio attivo farmaceutico (metoclopramide) dalle sostanze correlate utilizzando entrambi i sistemi ACQUITY UPLC e ACQUITY UPC² dimostra questa ortogonalità (Figura 53). I picchi non risolti da una tecnica vengono risolti dall’altra e viceversa. La CC è in grado di trattenere composti polari più a lungo rispetto all’RPLC (per esempio, i picchi 1 e 2). In questo esempio, il sistema ACQUITY UPC² risolve le coppie critiche (picco 5 e metoclopramide), facilitando così la purificazione su larga scala e l’isolamento di composti incogniti per la successiva identificazione e caratterizzazione. Tutto ciò rende la CC una tecnica ideale da utilizzare in parallelo ad altre tecniche di routine per contribuire a risolvere una serie di problemi di separazione.

I metodi ortogonali sono importanti anche per separare gli analiti di interesse dalle interferenze della matrice, per esempio nelle bioanalisi o nelle analisi alimentari.

La Figura 54A mostra un tipico esempio di cromatogramma LC-MS/MS di clopidogrel estratto da plasma umano mediante precipitazione proteica. A causa della sua idrofobicità, il clopidogrel eluisce piuttosto tardi durante l’analisi. Anche i fosfolipidi interferenti (con un gruppo di testa contenente colina) eluiscono in questa stessa regione (Figura 54B), causando potenzialmente la soppressione ionica del picco di clopidogrel e la quantificazione della variabile. È interessante notare che i fosfolipidi interferenti eluiscono all’incirca nella stessa regione sul sistema ACQUITY UPC² (Figura 54C). A causa dell’ortogonalità della CC rispetto all’LC in fase inversa, l’analita di interesse eluisce molto prima e lontano da questi fosfolipidi interferenti (Figura 54D). In questo modo si riduce al minimo la possibilità di effetti matrice, garantendo una quantificazione più accurata e precisa.

Tutti questi vantaggi mostrano i tre attributi chiave della CC, come menzionato in precedenza in questo capitolo:

1. La cromatografia convergente semplifica il workflow
2. La cromatografia convergente separa i composti con similarità strutturale
3. La cromatografia convergente è ortogonale rispetto all’LC in fase inversa

• Combina più tecniche in una sola
• Riduce i tempi di preparazione e analisi dei campioni
• Può essere utilizzata per l’iniezione diretta di estratti/solventi organici

• Enantiomeri (chirali)
• Isomeri di posizione
• Coniugati e omologhi strutturali

• Maggiore sicurezza nell’identificazione di impurezze/sostanze di degradazione
• Caratterizzazione completa del campione
• Separazione degli analiti dalle interferenze della matrice