Guida alla Cromatografia in Size Exclusion per Principianti

Quali colonne devo utilizzare e perché?

La selezione della colonna è fondamentale per ottenere la corretta distribuzione del peso molecolare del polimero di interesse.

Fattori iniziali da considerare: solubilità

Solubile in acqua:

• Linea di colonne Ultrahydrogel

Solubile organico:

• Styragel HR per lavori ad alta risoluzione
• Styragel HT per lavori ad alta temperatura
• Styragel HMW per polimeri ad altissimo peso molecolare

Con quale solvente devo acquistare le colonne impaccate e perché?

Le colonne HR, HT e HMW sono impaccate in:

• THF
• Toluene
• DMF

Sono disponibili colonne speciali impaccate in metanolo per analisi a temperatura ambiente con HFIP (esafluoro isopropanolo). Se si utilizza un solvente diverso da questi quattro per l'applicazione, è necessario considerare qualche regola pratica. Se si esegue un'applicazione a "temperatura ambiente" in un solvente come cloroformio o cloruro di metilene, eseguire la conversione da THF. Se si prevede di eseguire operazioni ad alta temperatura in TCB, ODCB, per esempio, eseguire la conversione da toluene a ~85-90 °C. Se si intende utilizzare un solvente molto polare, come DMAC (dimetilacetammide) o NMP (n-metilpirrolidone), eseguire la conversione da DMF.

Al momento ho colonne nel solvente “A” e desidero passare al solvente “B”.

In genere, è possibile passare direttamente da un solvente all'altro a una velocità di 0,1-0,2 mL/min (consultare il manuale per la manutenzione e l'uso della colonna) se i due solventi sono miscibili. Se i solventi non sono miscibili, è necessario utilizzare un solvente intermedio (in cui sono miscibili entrambi i solventi).

In quale ordine devo posizionare le colonne e perché?

In genere non è importante l'ordine in cui sono posizionate le colonne. L'ordine non influirà sui calcoli della distribuzione del peso molecolare del polimero in eluizione. È una buona idea, tuttavia, posizionare sempre le colonne da 100 Å o 50 Å alla fine della serie, poiché il gel di stirene/divinilbenzene contenuto in queste colonne tende a essere più morbido e a durare meno.

Quale velocità di flusso devo utilizzare nella colonna GPC?

Si raccomanda di non superare 1,0 mL/min per le colonne analitiche con un diametro interno di 7,8 mm. La risoluzione "ottimale" per queste colonne è compresa tra 0,70 e 0,80 mL/min circa. La velocità di flusso ottimale per le colonne a passaggio stretto con un diametro interno di 4,6 mm è compresa tra 0,3 e 0,35 mL/min. Consultare il manuale per la manutenzione e l'uso per maggiori dettagli.

Devo aumentare gradualmente il flusso e la temperatura all’avvio delle colonne?

È obbligatorio aumentare la velocità di flusso per le colonne analitiche GPC, in particolare per le colonne della serie HR. Un aumento improvviso del flusso (e di conseguenza della pressione) danneggerà sicuramente le colonne. L'aumento della temperatura non è così critico. In genere si aumenta la velocità di flusso da 0,0 a 1,0 mL/min in un intervallo di 60 secondi e la temperatura da quella ambiente a 150 °C (ad esempio) nell'arco di diverse ore.

Come si sceglie l’intervallo di dimensioni dei pori delle colonne?

L'intervallo delle dimensioni dei pori viene scelto determinando l'intervallo approssimativo di peso molecolare del campione di interesse. Se si sa che l'intervallo di peso molecolare è basso, per esempio nel caso di una resina epossidica, dovrebbe essere utilizzata un set di colonne da 103, 500, 100 e forse una colonna da 50 Å. Se il campione di interesse è un PVC a peso molecolare medio, viene utilizzato un set 103, 104 e 105. La scelta di singole dimensioni dei pori in base all'intervallo di peso molecolare del polimero garantisce la massima risoluzione. Se l'intervallo di peso molecolare non è noto o è molto ampio, è opportuno utilizzare colonne a letto misto (ovvero colonne "lineari" o "a intervallo esteso") che forniscono una miscela di dimensioni dei pori.

Cos’è la risoluzione e quanta me ne serve?

Nell'analisi GPC, per risoluzione si intende l'intervallo di peso molecolare separato in un volume incrementale di eluizione. È bene massimizzare questo parametro il più possibile. Il modo più semplice per farlo è aggiungere più colonne (e quindi aumentare, sfortunatamente, il tempo di analisi). Un altro modo consiste nell'utilizzare particelle di dimensioni inferiori (~ 5 μm) per aumentare l'efficienza. Lo svantaggio, in questo caso, è la durata della colonna. Nelle separazioni in cui sono presenti oligomeri, additivi e distribuzioni multimodali, la risoluzione può essere importante. Se il campione è un polietilene ad alta densità con un'ampia distribuzione, la risoluzione potrebbe non essere così importante.

Waters produce colonne nell'intervallo ad alta risoluzione (serie HR) pari a 5 μm, la serie HT a ~10 μm (adatte per operazioni ad alta temperatura e in caso di sostituzione di più solventi) e la serie HMW, che contengono particelle da 20 μm. Queste sono adatte a campioni di peso molecolare molto elevato in cui il taglio è un problema e la risoluzione non è così critica.

Cos’è uno standard “monodisperso”? Cos’è uno standard “polidisperso”?

• Gli standard "monodispersi" sono quelli in cui la polidispersità è inferiore a ~1,10. La polidispersità è definita come il rapporto tra il peso molecolare medio ponderale (Mw) e il peso molecolare medio numerico (Mn).
• Gli standard "polidispersi" hanno polidispersità maggiori di 1,10 e in genere sono lo stesso polimero del campione da analizzare.

Se si utilizzano standard “monodispersi”, è possibile iniettare più di uno standard alla volta?

Nella GPC convenzionale con rivelazione RI è sicuramente accettabile iniettare una miscela di standard, purché sia presente una risoluzione sufficiente tra gli standard eluiti. Ne suggeriamo un massimo di tre. Con la rivelazione avanzata come la viscosimetria, in cui l'area sotto la curva per lo standard deve essere nota con precisione, iniettare uno standard alla volta.

Quali standard devo utilizzare per il mio polimero?

Per la maggior parte delle persone, una calibrazione "relativa" con standard monodispersi va bene. In questo caso, gli standard di polistirene sono la scelta usuale per la GPC organica, ma è possibile utilizzare standard monodispersi di PMMA, poliisopreni, polibutadieni e poliTHF. Per la GPC acquosa sono disponibili ossidi polietilenici, glicoli polietilenici e pullulani (polisaccaridi). Se l'utilizzatore necessita del peso molecolare "vero" (rispetto al fatto che il calibrante non è sufficientemente buono), è possibile utilizzare lo standard polidisperso (o di riferimento) con la stessa natura chimica dei campioni.

Quanto sono affidabili gli standard polidispersi?

Nella maggior parte dei casi, gli standard polidispersi disponibili in commercio sono stati ben caratterizzati da tecniche che forniscono un ragionevole Mw, Mn, Mz, ecc. Quando si acquistano questi standard c'è una certa fiducia che i valori riportati siano accurati e ottenuti con precisione eccellente. Dopotutto, la curva di calibrazione si basa su questi valori. È anche possibile inviare un campione rappresentativo, tipico dei campioni analizzati in laboratorio, affinché venga analizzato con queste tecniche ausiliarie. Molti laboratori a contratto e università possono eseguire queste analisi e fornire i valori Mn, Mw, Mz, ecc. del campione che si desidera utilizzare come standard polidisperso.

È possibile utilizzare i valori k e alfa del Polymer Handbook?

Il concetto di calibrazione universale, lo sviluppo di una calibrazione basata sul volume idrodinamico logaritmico anziché sul peso molecolare logaritmico, consente di ottenere pesi molecolari "assoluti" per gli incogniti. Un grafico del log [viscosità intrinseca] in funzione di log [peso molecolare] dà luogo a quello che viene definito grafico di "Mark-Houwink" o "legge della viscosità". La pendenza di questa curva è alfa e l'intercetta determina k (costanti di Mark-Houwink). In assenza di un viscosimetro in linea, è possibile utilizzare le costanti di Mark-Houwink, a condizione che siano ben note non solo per gli standard monodispersi per sviluppare la calibrazione universale, ma anche per quelli incogniti. I valori riportati nel Polymer Handbook devono rientrare nel corretto polimero di interesse, nell'intervallo di peso molecolare corretto, nel solvente utilizzato e alla temperatura di funzionamento.

Come si prepara la fase mobile?

Nella maggior parte dei casi, l'unico passaggio richiesto per preparare la fase mobile è la filtrazione. Il solvente deve essere filtrato attraverso un filtro di fluorocarbonio da 0,45 μm (micron), di tipo acetato per la GPC acquosa.

Quali additivi sono importanti e quando devo utilizzarli?

In alcuni casi è necessario un additivo per la fase mobile. Per esempio, bromuro di litio 0,05M viene aggiunto a solventi polari come DMF, DMAC e NMP. Questi solventi polari sono utilizzati per analizzare polimeri polari come poliuretani o poliimmidi e si verifica un'interazione dipolo che provoca la comparsa di picchi secondari sull'estremità ad alto peso molecolare della distribuzione. Questa interazione viene eliminata con l'aggiunta del sale. Nell'analisi ad alta temperatura di poliolefine, alla fase mobile (TCB, per esempio) deve essere aggiunto circa un grammo per 4 litri di un antiossidante (va bene la maggior parte dei fenoli inibiti). Ciò contribuisce a ridurre l'ossidazione del campione mentre si trova nel carosello dei campioni ad alta temperatura prima dell'iniezione.

Come si preparano i campioni? (ovvero temperatura, tempo e miscelazione)

La domanda principale da porsi prima di provare a eseguire l'analisi GPC è: in cosa è solubile il campione? Waters ha iniziato come azienda che si occupava di GPC e ha sviluppato un lungo elenco di solventi e temperature per quasi tutti i polimeri che siano mai stati analizzati da GPC. Il tempo necessario al campione per dissolversi (a temperatura ambiente o elevata) dipende in genere da due fattori: il peso molecolare e la cristallinità. Maggiore è il peso molecolare e più è cristallino il polimero, maggiore è il tempo necessario per la dissoluzione. In genere, il campione viene disciolto in due o tre ore con una leggera agitazione. In alcuni casi (per esempio, polietilene ad altissimo peso molecolare) sono necessarie diverse ore. È necessario evitare la miscelazione ad alta velocità, la dissoluzione a ultrasuoni e la dissoluzione a microonde, a meno che non vengano eseguite senza degradazione del polimero.

Quale concentrazione e volume di iniezione devo utilizzare?

Come regola pratica, un polimero con un peso molecolare di picco di 100 000 deve essere preparato nel solvente a una concentrazione di ~0,10-0,12% (peso/volume). Ciò rappresenta approssimativamente da 1 a 1,2 mg di campione (o standard) per mL di solvente. All'aumentare del peso molecolare, la concentrazione dovrebbe diminuire di conseguenza. Un polimero ad alto peso molecolare (per esempio ~3 000 000 di peso medio) deve essere analizzato a una concentrazione <0,02% (p/v). Al contrario, una resina epossidica con peso molecolare inferiore a 1000 può essere analizzata a una concentrazione dello 0,20%.

A queste concentrazioni, il volume di iniezione massimo per colonna da 7,8 x 30 mm non deve superare 100 μL.

Quali sono i vantaggi di avere un viscosimetro e/o un rivelatore light scattering in linea?

Poiché i chimici per la caratterizzazione dei polimeri desiderano ottenere maggiori informazioni sui loro campioni specifici, sempre più persone si orientano verso tecniche di "rivelazione avanzata". Avere un viscometro in linea con il rivelatore dell'indice di rifrazione offre tre vantaggi principali rispetto al solo RI:

• Peso molecolare "assoluto" tramite calibrazione universale
• Viscosità intrinseca del polimero attraverso la distribuzione
• Informazioni di ramificazione correlate alla ramificazione a catena lunga

Il rivelatore light scattering consente di ottenere:

Peso molecolare medio ponderale (Mw) "assoluto" senza stabilire un raggio della curva di calibrazione di rotazione delle informazioni di ramificazione del polimero come per il viscosimetro.