Guida alla Cromatografia Convergente per Principianti

Il meccanismo di base di qualsiasi separazione cromatografica consiste nel creare le condizioni in cui tutte le molecole degli analiti presenti nella miscela di campioni si muovono all’interno del sistema, ma a velocità diverse, in modo che quando eluiscono dalla colonna analitica siano sufficientemente separate l’una dall’altra per essere rivelate e quantificate. Per mettere in atto questo processo, la cromatografia ha due componenti principali: una fase stazionaria e una mobile. Il ruolo principale della fase stazionaria è di arrestare o trattenere il movimento dei composti, mentre quello della fase mobile è di trattenere e anche forzare i composti a spostarsi dall’ingresso all’uscita del sistema. Questo è il meccanismo fondamentale per la cromatografia GC, LC o CC. La principale differenza tra CC e LC o GC risiede nel modo in cui le proprietà della fase mobile influenzano i rispettivi comportamenti cromatografici.

Ruolo della Fase Mobile nella CC rispetto alla LC e alla GC

Nella GC, di solito la fase mobile è un gas inerte o non reattivo, in genere He o N₂. Alle temperature e alle pressioni di funzionamento della GC la fase mobile non è in grado di solvatare le molecole dell’analita né modificare la superficie della fase stazionaria. La fase mobile della GC funge principalmente da trasporto o motore per le molecole dell’analita nella colonna GC. La ritenzione e la separazione degli analiti sono impartite esclusivamente attraverso le interazioni tra le molecole degli analiti e la fase stazionaria. Sono impartite esclusivamente attraverso le interazioni tra le molecole degli analiti e la fase stazionaria. Questo schema è illustrato nella Figura 3 con lo spazio vuoto attorno alle molecole degli analiti.

Invece nell’LC la fase mobile ha un ruolo attivo: le sue molecole interagiscono fortemente sia con le molecole degli analiti che con la fase stazionaria. La fase mobile influenza la ritenzione degli analiti non solo solvatandoli direttamente, ma anche influenzando le interazioni tra analita e fase stazionaria, contendendosi la superficie della fase stazionaria (Figura 3). 

La Figura 3 presenta l’LC in entrambe le modalità RPLC e NPLC. Da notare che una delle principali differenze tra queste due modalità LC risiede nella composizione della fase mobile: l’RPLC è a base di acqua mentre l’NPLC è a base organica. Nell’RPLC, la fase mobile a base di acqua, unitamente alla fase stazionaria C₁₈, modifica efficacemente le interazioni tra gli analiti e la fase stazionaria, svolgendo quindi un ruolo importante nella risoluzione degli analiti dei campioni in un’ampia gamma di miscele di composti. Nello sviluppo del metodo RPLC, la prima modifica viene spesso apportata alla fase mobile e non alla fase stazionaria. Nell’NPLC, invece, la fase mobile a base di esano o eptano assume un ruolo relativamente moderato e la separazione viene impartita in gran parte dalla variazione della composizione chimica della fase stazionaria.

Il ruolo della fase mobile nella CC è intermedio tra l’RPLC e l’NPLC date le proprietà uniche della CO₂, supercritica o meno. La CO₂ compressa non è polare, come l’eptano o l’esano. Sulla base di ciò, la CC è più simile all’NPLC, ma una differenza fondamentale è che la CO₂ è in grado di miscelarsi completamente con i co-solventi polari, per esempio il metanolo, l’etanolo, l’acetonitrile, ecc. e può quindi essere utilizzata in modalità a gradiente, a differenza dell’NPLC che viene quasi sempre utilizzata in modalità isocratica. Inoltre, le fasi mobili della CC tollerano molto meglio la presenza di piccole quantità d’acqua rispetto all’NPLC, che possono svolgere un ruolo importante nell’eluizione dell’analita.

Nella prossima sezione viene presentato un confronto sistematico tra la CC con l’RPLC e l’NPLC in base alle differenze di proprietà tra i rispettivi solventi principali.

Ruolo delle Proprietà della CO2 nell’Influenzare il Comportamento Cromatografico

Miscibilità della CO2 con altri solventi

La CO₂ è un solvente non polare con un indice di polarità simile all’eptano (=0,1), ma a differenza dell’eptano, la CO₂ ha un momento quadruplo diverso da zero (-13·4 ± 0·4 × 10^–40 C m²) ed è completamente miscibile con solventi organici altamente polari, per esempio l’acetonitrile (indice di polarità = 5,8) e il metanolo (indice di polarità = 5,1). Sebbene sia scarsamente miscibile con l’acqua (indice di polarità = 10,2), è miscibile con metanolo/acqua, isopropanolo/acqua o miscele di acetonitrile/acqua con notevoli percentuali d’acqua. Un intervallo di miscibilità così ampio consente alla fase mobile della CC di estendere la propria polarità su un intervallo più ampio rispetto alle fasi mobili dell’NPLC e dell’RPLC. La Tabella 1 presenta un quadro conciso della situazione in termini di valori eluotropici (intensità di eluizione) e di indici di polarità dei solventi utilizzati per l’RPLC, l’NPLC e la CC.

Da notare che nella Tabella 1 la fase mobile a base acquosa dell’RPLC può impiegare solo un intervallo limitato della serie eluotropica a causa della limitata miscibilità dell’acqua con la maggior parte degli altri solventi organici. Analogamente per l’NPLC, la fase mobile a base di esano/eptano non consente un intervallo eluotropico ampio a causa della limitata miscibilità delle sostanze organiche non polari con solventi altamente polari. Un ulteriore problema dell’NPLC è che non tutti i solventi organici sono ampiamente miscibili nemmeno tra loro, con conseguente incompatibilità di alcune miscele. Al contrario, per la CC la CO₂ compressa è miscibile con tutti gli altri solventi dell’intera serie eluotropica, consentendo di scegliere un’ampia gamma di fasi mobili per influenzare la selettività delle separazioni (vedere la Tabella 1). Anche se la CO₂ non è polare, la CC è paragonabile all’RPLC perché può avere una forza eluotropica molto più ampia, in particolare sul lato della polarità più alta, rispetto all’NPLC. Per esempio, combinando la CO₂ con il metanolo, l’intensità eluotropica della fase mobile può essere programmata da 0 a 0,73 E^o.

Oltre all’intervallo eluotropico esteso, la fase mobile a base di CO₂ della CC è compatibile con il numero più ampio di chimiche in fase stazionaria. Nella Tabella 2 sono elencate le fasi stazionarie comunemente impiegate per l’NPLC e l’RPLC. La maggior parte delle separazioni RPLC viene eseguita con fasi stazionarie C₁₈, mentre un numero relativamente ridotto di casi utilizza altre fasi legate. Alcune fasi stazionarie elencate non possono essere utilizzate con l’RPLC a causa della loro maggiore polarità. Analogamente all’NPLC, la selezione della colonna è vincolata dall’intervallo di polarità della fase mobile. Con la CC, dato l’intervallo di polarità più ampio, è possibile selezionare tutte queste fasi stazionarie delle colonne, aprendo così una gamma più ampia di opzioni di selettività (vedere la Figura 4). Come notato da West e Lesellier, dal momento che tutte queste fasi stazionarie possono funzionare con una fase mobile della stessa composizione, si apre l’entusiasmante possibilità di accoppiare colonne con polarità molto diverse.

Un altro motivo dell’importanza della miscibilità della CO₂ è che la CC è compatibile con un’ampia gamma di diluenti dei campioni (solvente in cui viene dissolto o diluito il campione). Questa funzionalità della CC incide notevolmente sul workflow complessivo del laboratorio. Spesso il collo di bottiglia maggiore in un laboratorio cromatografico è rappresentato dalla preparazione dei campioni. I metodi più comuni di preparazione dei campioni comportano la dissoluzione degli analiti di interesse in un solvente incompatibile con il sistema LC in uso. Per esempio, molti analiti si dissolvono facilmente in un solvente organico che, di conseguenza, ne migliora l’estrazione. Poiché quantità elevate di solventi organici sono incompatibili con l’RPLC, spesso sono necessari step aggiuntivi per convertire la soluzione organica o l’estratto per renderlo compatibile con l’RPLC (Figura 5). La CC è compatibile con l’iniezione diretta di campioni dissolti in solventi organici, non sono più necessari step per l’evaporazione dei solventi organici e la ricostituzione (molto lunga) del campione nei diluenti a base acquosa richiesti per le separazioni in fase inversa. Ciò si traduce in un notevole risparmio sui costi di un’analisi complessiva. Inoltre, il tempo di analisi può essere ridotto molto, con un impatto complessivo significativo, in particolare per i laboratori che eseguono più sistemi RPLC impostati per l’analisi di numerosi campioni.

In breve, combinando la CO₂ compressa non polare con un co-solvente a entrambi gli estremi dello spettro eluotropico, abbinando una maggiore diversità di fasi stazionarie compatibili con la CC, è possibile esplorare uno spazio di selettività eccezionalmente ampio, rendendo la CC applicabile a un’ampia gamma di separazioni complesse.

Proprietà di trasporto della CO2

Un altro vantaggio delle proprietà della CC è la bassa viscosità e la conseguente elevata diffusività delle molecole degli analiti in fase mobile CC. Dal punto di vista delle proprietà fisiche, l’efficienza di una colonna cromatografica è controllata dalla diffusività dell’analita nella fase mobile. Maggiore è la diffusività di una molecola, più velocemente si sposta all’interno e all’esterno dei pori delle particelle stazionarie, con conseguente elevata efficienza anche alla velocità elevata della fase mobile. Nella CC, anche dopo aver aggiunto volumi significativi di modificatore liquido (per esempio per CO₂/metanolo (70/30, mol/mol %), la viscosità della fase mobile è almeno pari alla metà di quella delle fasi mobili LC (vedere la Tabella 3). Ciò significa che la CC può funzionare a velocità di flusso della fase mobile molto più elevate senza compromettere l’efficienza della colonna. Ciò rende la CC un ottimo candidato per le analisi ad alta produttività.

La CC presenta un vantaggio significativo in due aree di applicazione chiave, ovvero lo screening chirale rapido e a sostituzione della cromatografia in fase diretta per le separazioni achirali. Per lo screening chirale, il tempo di analisi si riduce di sette volte, vale a dire da 20 minuti a soli 3 minuti, a fronte di un incremento della risoluzione. Questo miglioramento è stato determinato principalmente dall’impiego del gradiente di solvente nella CC, che non era possibile nell’NPLC. Un altro vantaggio della CC è il minor consumo di solvente, portando a una notevole riduzione dei costi.

La sostituzione di solventi organici in fase diretta con una fase mobile costituita principalmente da CO₂ compressa (Figura 6) riduce il costo per analisi da circa sei dollari a soli cinque centesimi per campione. Ne deriva un impatto finanziario complessivo eccezionale derivante dalla riduzione dei tempi di analisi, così come dei costi di acquisto e smaltimento dei solventi.

Ruolo di Altre Proprietà Vantaggiose

Nella Tabella 4 sono elencati i vantaggi delle fasi mobili CC rispetto alle fasi mobili LC. Oltre ai vantaggi di miscibilità e bassa viscosità, si aggiunge anche una bassa tensione superficiale. Una bassa tensione superficiale consente alla fase mobile di entrare più rapidamente nei pori delle particelle della fase stazionaria, portando a un’equilibrazione più rapida della colonna.

Un’altra proprietà della CO₂, che rende la CC molto allettante come sistema cromatografico, è che è più economico e sicuro da utilizzare, oltre a essere più sostenibile. La CO₂ è prontamente disponibile e non dipende da altre procedure operative critiche (per esempio quelle dell’acetonitrile come sottoprodotto dell’industria petrolchimica). La CO₂ di grado commerciale è neutra in termini di emissioni di carbonio ed è considerata un solvente ecologico. La CO₂ costa molto meno degli altri solventi organici e la CO₂ può essere scaricata direttamente nell’atmosfera (se non viene riciclata) senza dover sostenere costi di smaltimento.

La CO₂ non è infiammabile, non è tossica ed è più facile da conservare. È impossibile trovare una fase mobile che combini le proprietà di miscibilità e bassa viscosità della CO₂ che sia economica ed ecologica quanto la CO₂, il che rende la CC superiore all’LC per molte applicazioni. Il vantaggio complessivo di tutte queste proprietà, elencate nella Tabella 4, rende la CO₂ un solvente unico.

Supercritica o No?

Come affermato in precedenza, da un punto di vista cromatografico nella CC non importa se la fase mobile è supercritica o meno. Tuttavia, per eseguire la separazione cromatografica è assolutamente necessario che la fase mobile CC sia omogenea e non una miscela eterogenea di gas e liquido. Per garantire che sia omogenea, la fase mobile della CC viene mantenuta al di sopra di una certa pressione, che può essere facilmente impostata tramite un regolatore di contro-pressione automatizzato (ABPR).