Chimica di Base per GPC

Introduzione alla separazione in base alle dimensioni

La cromatografia a permeazione su gel (GPC), nota anche come cromatografia in size exclusion (SEC), è in realtà la tecnica di cromatografia liquida più facile da comprendere. La separazione si basa strettamente sulle dimensioni del campione in soluzione e non deve esserci interazione con l'impaccamento della colonna (adsorbimento, partizione, ecc.), come nel caso dell'HPLC convenzionale. La modalità di separazione non si basa sul peso molecolare, ma sulle dimensioni del materiale in analisi (in genere un polimero) in soluzione. In altre parole, per eseguire correttamente la GPC, il campione deve essere disciolto in un solvente adeguato.

La concentrazione del campione in soluzione dipende dal peso molecolare, ma è tipica una concentrazione dello 0,10% (p/v) per un polimero di peso molecolare ~100 000. (Per ulteriori informazioni, consultare la sezione Preparazione del campione qui sotto.) A volte, la soluzione del campione deve essere riscaldata per dissolvere il campione. Per esempio, alcune poliolefine necessitano di temperature superiori a 120 °C per dissolversi e in genere vengono analizzate in 1,2,4-triclorobenzene a 140 °C.

Una volta che il campione è stato adeguatamente disciolto, viene introdotto tramite un meccanismo di iniezione su una serie di colonne che fungono da sistema di filtrazione molecolare. Le colonne sono impaccate con un gel reticolato (ad esempio, un copolimero di stirene/divinilbenzene) che contiene pori in superficie. Questi pori possono variare da piccoli ad abbastanza grandi e agire come i suddetti filtri molecolari. Le molecole di dimensioni maggiori non entrano nei pori più piccoli. Al contrario, le molecole più piccole si inseriscono nella maggior parte dei pori e vengono trattenute più a lungo.

Una delle prime dimostrazioni della GPC eseguite da Waters decenni fa riguardava una gomma da masticare. La gomma da masticare è in realtà gomma sintetica che contiene, in aggiunta, additivi come aromi, stabilizzanti, ecc.

Di seguito è riportata una rappresentazione del cromatogramma GPC originale, separato su diverse colonne di varie dimensioni dei pori collegate in serie. Il polimero (la gomma in questo caso) eluisce per primo perché è la molecola più grande, seguita dagli "additivi" in ordine decrescente di dimensione. Potrebbe trattarsi di un cromatogramma di PVC con una miscela di plastificanti, antiossidanti e stabilizzanti ai raggi UV.

Monomeri, Oligomeri, Polimeri e Distribuzioni del Peso Molecolare

I monomeri hanno un unico peso molecolare e sono detti monodispersi. Esempi sono etilene, stirene, vinil cloruro, ecc. Dopo i monomeri ci sono dimeri, trimeri, tetrameri, pentameri, ecc., che vengono chiamati oligomeri. Man mano che si raggiungono pesi molecolari più elevati, il gruppo prende il nome di polimeri. I polimeri presentano una particolare distribuzione delle lunghezze delle catene e, di conseguenza, dei pesi molecolari. A seconda di come è stata eseguita la polimerizzazione, questa distribuzione può essere stretta o abbastanza ampia. Per esempio, un polimero di condensazione o polimero a stadi, come un poliestere (polietilene tereftalato), presenterà una distribuzione abbastanza stretta dei pesi molecolari. D'altra parte, una polimerizzazione a radicali liberi può produrre un polimero con una distribuzione molto ampia di lunghezze di catena e pesi molecolari (come per le poliolefine). Il controllo della cinetica della polimerizzazione è estremamente importante per ottenere la distribuzione del peso molecolare desiderata. Ecco perché la tecnica GPC è così importante per il chimico dei polimeri.

Di seguito viene mostrata una sovrapposizione di due distribuzioni di peso molecolare di un polimero (in questo caso polistirene):

Una volta ottenuta la distribuzione del peso molecolare del campione di polimero, è necessario trovare un modo per quantificarla. Per assegnare le medie di peso molecolare a questa distribuzione è sufficiente eseguire un calcolo statistico. A ciascuna porzione sono attribuiti un'altezza, (Hi, rappresentata anche come concentrazione, Ci), un tempo di ritenzione e un peso molecolare (Mi). Il peso molecolare si ottiene da una curva di calibrazione (consultare la sezione successiva). Si esegue quindi una somma per ottenere le varie medie del peso molecolare che descrivono la distribuzione del peso molecolare del polimero. La PD mostrata è il rapporto tra i pesi molecolari medi ponderali e numerici ed è denominata polidispersità, o talvolta semplicemente dispersione del polimero. Questa somma è solo un modo semplice per ottenere questi quattro momenti statistici del peso molecolare e descrivere la distribuzione del peso molecolare.

Esistono altre tecniche per ottenere queste medie di peso molecolare:

• La media numerica, Mn, può essere ottenuta tramite osmometria di membrana o analisi dei gruppi terminali (titolazione, NMR, ecc.).
• La media ponderale, Mw, può essere ottenuta mediante light scattering.
• La media Z, Mz, e la media Z + 1, Mz + 1, possono essere ottenute mediante ultracentrifugazione.

Una volta calibrato il sistema GPC, è possibile ottenere tutte queste medie con una singola iniezione.

Configurare un Sistema GPC

Ora che abbiamo capito cosa sono le medie di peso molecolare, siamo pronti per mettere insieme un sistema.

Il sistema (illustrato sopra) è costituito da una pompa, da un iniettore di tipo manuale o automatizzato, dal set di colonne, dal rivelatore o dai rivelatori e da un dispositivo di gestione dei dati. Inoltre è consigliabile utilizzare un degassatore, in particolare quando si utilizza THF con un rivelatore a indice di rifrazione. Le colonne sono quasi sempre riscaldate a una temperatura elevata, anche per applicazioni solubili a temperatura ambiente, per garantire bassi cali di pressione e viscosità uniformi. Tratteremo ora il sistema in modo più dettagliato.

Sistema di Gestione degli Eluenti

Le pompe oggi utilizzate con i sistemi GPC Waters sono dispositivi molto sofisticati per il trattamento dei fluidi. Nel caso del sistema idraulico utilizzato nel sistema Alliance, si tratta in realtà di un sistema di gestione degli eluenti. L'aspetto più importante da considerare nella scelta di un modulo idraulico per l'analisi GPC è la precisione del flusso. La calibrazione del sistema è un grafico del tempo di ritenzione (o volume) in funzione del logaritmo del peso molecolare. Qualsiasi piccola fluttuazione del flusso comporta un errore potenzialmente grave nel peso molecolare. È vantaggioso utilizzare il dispositivo più preciso possibile per la gestione dei fluidi. Ciò migliorerà immensamente la precisione delle misurazioni del peso molecolare rispetto ad alcune pompe tradizionali a bassa precisione ancora in uso. Con il sistema di gestione degli eluenti utilizzato con il sistema Alliance, la precisione del flusso è notevolmente inferiore a 0,075% senza alcuna correzione della velocità di flusso! Alcune pompe sul mercato sostengono di possedere una precisione di flusso simile, ma sono dotate di un software per correzione della velocità di flusso. Diffidare delle pompe sul mercato che riportano una specifica dello 0,3% (e anche peggiore) se si sta assemblando un sistema GPC.

Il sistema di gestione degli eluenti Alliance offre inoltre prestazioni eccezionali per i programmi di flusso e gradiente. Molti chimici per la caratterizzazione dei polimeri si stanno rendendo conto dell'importanza dell'analisi del pacchetto di additivi, oltre alla determinazione della distribuzione del peso molecolare del polimero. In molti casi, il pacchetto di additivi ha tanto a che fare con la corretta applicazione di un prodotto finito quanto il polimero utilizzato per fabbricare il prodotto. Eventuali errori nella compoundazione (ad esempio un antiossidante errato o livelli non corretti di plastificante) degli additivi nella formulazione principale possono compromettere le proprietà fisiche e le prestazioni. Per caratterizzare correttamente il pacchetto di additivi, viene eseguita un'analisi HPLC a gradiente in fase inversa. Oltre agli additivi polimerici, le resine epossidiche e fenoliche vengono regolarmente analizzate sia tramite GPC (per esaminare la distribuzione degli oligomeri) sia tramite HPLC a gradiente (per caratterizzare l'isomero e le impurezze). Il sistema Alliance consente di eseguire analisi GPC e analisi del gradiente ad alte prestazioni con un unico sistema.

Sistema di Gestione dei Campioni

Il passaggio successivo della configurazione del sistema consiste nel decidere come introdurre gli standard e i campioni per la separazione. Il modo meno costoso per eseguire questa operazione è utilizzare un iniettore manuale. Si riempie manualmente un loop (volume noto) e si apre una valvola per consentire il flusso della soluzione sul set di colonne con il flusso dell'eluente. Questo va bene se si analizzano solo alcuni campioni di tanto in tanto. Tuttavia, se si analizzano più campioni al giorno, potrebbe essere più opportuno utilizzare un campionatore automatico.

Il campionatore automatico attualmente utilizzato per l'analisi GPC a temperatura ambiente è il campionatore automatico 2707. Questo campionatore automatico completamente elettrico consente di impostare un vassoio completo di campioni per l'analisi senza doverla monitorare costantemente. L'accuratezza e la riproducibilità del volume di iniezione sono insuperabili, il che è fondamentale per le misurazioni di massa del rivelatore sensibile al peso molecolare (come nel caso di un viscosimetro o di un rivelatore light scattering), in cui è necessario conoscere l'esatto caricamento della massa. Un'altra opzione per un campionatore automatico è il sistema Alliance. Sono disponibili cinque diversi caroselli, ciascuno in grado di contenere fino a 24 campioni (capacità totale di 120 campioni).

Selezione della colonna

Una volta trovato un solvente adatto per dissolvere il polimero e una volta preparati gli standard monodispersi e i campioni alla concentrazione corretta, siamo pronti per iniziare l'analisi. Dopo aver scelto il set di colonne corretto per eseguire l'analisi siamo pronti a partire. Esaminiamo ora la procedura per scegliere il set di colonne corretto.

A molti piace utilizzare quelle che un tempo venivano chiamate colonne "lineari", che sono anche chiamate colonne "a intervallo esteso" o "a letto misto". Queste colonne sono miscele di diverse dimensioni dei pori, con l'obiettivo di coprire un intervallo di peso molecolare più ampio rispetto a una colonna con una singola dimensione dei pori. Se la miscelazione dei pori viene eseguita con sufficiente attenzione, la curva di calibrazione della colonna potrebbe essere lineare.

Lo svantaggio dell'utilizzo di queste colonne a letto misto è che si ottiene una risoluzione inferiore su un intervallo molecolare finito rispetto all'utilizzo di colonne con dimensioni dei pori individuali. Per esempio, nell'analisi di una serie di resine epossidiche o fenoliche, ad esempio con un intervallo di peso molecolare compreso tra poche centinaia e cinquemila, quale set di colonne sarebbe meglio utilizzare? La prima considerazione è quella di disporre di un volume di pori sufficiente nel set di colonne per ottenere una separazione corretta, ossia il profilo di distribuzione corretto del polimero. Una colonna non è certo sufficiente, e persino due colonne potrebbero non bastare. Si dovrebbero utilizzare almeno tre colonne in serie per garantire un volume dei pori sufficiente a garantire una separazione corretta.

Ora, quali colonne sarebbe meglio utilizzare per analizzare la resina epossidica o fenolica? Si dovrebbe utilizzare un set di colonne a "letto misto", con diverse dimensioni dei pori? Oppure si dovrebbe utilizzare un set di colonne con singole dimensioni dei pori per individuare realmente l'intervallo di peso molecolare di interesse? Nella tabella seguente sono elencati gli intervalli dei pesi molecolari di separazione per le colonne con dimensioni singole dei pori con impaccamenti in stirene/divinilbenzene, in base ai limiti di esclusione della lunghezza delle catene di polistirene (in Angstrom):

Ancora un appunto sulle colonne. Esaminando la guida ai solventi GPC, si nota che è mostrato un intervallo tipico di temperature operative. Nell'analisi GPC riscaldiamo quasi sempre le colonne a una temperatura elevata, come mostrato nella guida ai solventi, (anche per applicazioni a temperatura ambiente). Lo scopo del riscaldamento delle colonne non è la dissoluzione, ma per incrementare la risoluzione della separazione, migliorare il processo di permeazione e, in alcuni casi, ridurre la viscosità del solvente (DMF, ad esempio) e ridurre la contro-pressione attraverso il banco di colonne 

Opzioni Rivelatore

Il rivelatore più utilizzato oggi per l'analisi GPC è il rifrattometro differenziale. È un rivelatore sensibile alla concentrazione che misura semplicemente la differenza nell'indice di rifrazione (dRI) tra l'eluente sul lato di riferimento e il campione + eluente sul lato del campione. Si tratta di un rivelatore "universale" (a differenza di un rivelatore UV, ad esempio) in quanto si otterrà una risposta per qualsiasi polimero che presenti una differenza significativa nell'indice di rifrazione rispetto all'eluente. In alcuni casi, il valore dRI per il campione e l'eluente (siliconi e THF, ad esempio) è molto ridotto e, di conseguenza, il segnale è scarso. In tal caso, è necessario trovare un altro eluente che dissolva il polimero e fornisca un dRI significativo. Il rifrattometro Waters 2414 (e i precedenti modelli 2410 e 410) sono lo standard del settore da molti anni.

Un altro rivelatore spesso utilizzato per la GPC è il rivelatore UV. Ovviamente, è necessario che sia presente un cromoforo che assorba nel campo UV per ottenere un segnale. Il rivelatore UV è eccellente per polimeri di tipo stirenico (polistirene, stirene/isoprene, stirene/butadiene, ABS, ecc.), epossidico, fenolico, policarbonati, poliuretani e poliesteri aromatici, ad esempio. Se viene eseguita l'analisi in gradiente (la composizione del solvente viene modificata nel corso dell'analisi) è necessario utilizzare il rivelatore UV, poiché il rivelatore RI continuerebbe a subire una deriva al variare della composizione dell'eluente. Il rivelatore UV Waters 2489 offre sensibilità, linearità e prestazioni complessive eccezionali per l'analisi GPC/HPLC di additivi e polimeri che assorbono i raggi UV.  

È anche possibile utilizzare un rivelatore a serie di fotodiodi (PDA), che rappresenta un passo avanti rispetto all'UV ed è un rivelatore potente e ricco di informazioni. In questo rivelatore viene utilizzata una serie di fotodiodi che consentono di osservare istantaneamente un'ampia varietà di lunghezze d'onda. Per esempio, è possibile impostare il rivelatore PDA in modo che osservi un intervallo di lunghezze d'onda compreso tra 190 e 800 nanometri (nm), anziché esaminare solo una o due lunghezze d'onda come per la maggior parte dei rivelatori UV. Ora possiamo esaminare gli spettri UV effettivi per il campione di polimero (o gli additivi). Questo ci consente di determinare qualche informazione sulla distribuzione della composizione chimica. Possiamo determinare se una SBR (gomma stirene/butadiene) è un copolimero a blocchi o casuale, per esempio. Possiamo creare librerie spettrali con le quali confrontare i nostri campioni sconosciuti. Questa operazione può essere eseguita per i polimeri o con additivi per polimeri. Possiamo ora cercare di identificare quali additivi sono presenti nei materiali finiti compoundati. Il rivelatore PDA può essere utilizzato anche per la deformulazione di composti della concorrenza.  

Poiché i chimici che si occupano di caratterizzazione dei polimeri vogliono conoscere il più possibile i loro campioni, vengono prese in considerazione altre opzioni di rivelazione. Man mano che entriamo nel mondo della rivelazione "avanzata" per l'analisi GPC, iniziamo a prendere in considerazione i rivelatori sensibili al peso molecolare come viscosimetria e light scattering. Il rivelatore viscosimetrico verrà descritto dettagliatamente nella sezione seguente relativa alla calibrazione. In sostanza, mettendo un rivelatore viscosimetrico in linea con il rifrattometro si ottiene non solo la viscosità intrinseca [h] del polimero, ma anche il peso molecolare "assoluto" e la stima della ramificazione di catena lunga. Il rivelatore RI è il rivelatore di concentrazione (C), mentre il viscosimetro fornisce [h](C). L'utilizzo dei due segnali in tandem ci consentirà di ottenere la viscosità intrinseca in corrispondenza di ciascuna porzione attraverso il profilo di eluizione del polimero. È quindi possibile utilizzare i concetti di calibrazione universale di Benoit descritti nella sezione successiva per ottenere il peso molecolare assoluto del campione di polimero.  

Il rivelatore light scattering, accoppiato al rifrattometro, è un'altra potente modalità di rivelazione avanzata per l'analisi GPC. In sostanza, un raggio laser viene focalizzato in una cella (in linea in questo caso) che contiene la soluzione del campione. Il fascio incidente viene disperso dalle particelle polimeriche in soluzione. A seconda del tipo di rivelatore light scattering (angolo ridotto o multiangolo), il peso molecolare medio ponderale, Mw, può essere misurato accuratamente con o senza il risultato del raggio di rotazione del polimero in soluzione.  

In entrambi i casi del viscosimetro e del rivelatore light scattering in tandem con RI, otteniamo svariate informazioni molto utili. L'utilizzo di un approccio a rivelatore triplo fornisce dati molto significativi, purché l'utilizzatore sia in grado di interpretarli tutti. Per una trattazione più dettagliata sulla riduzione dei dati per rivelatori multipli, fare riferimento alla nostra sezione di riferimento.  

Esistono altre tecniche per la rivelazione avanzata di polimeri e additivi, come la spettrometria di massa, ma i rivelatori comunemente utilizzati oggi per l'analisi GPC sono i rivelatori RI, UV/PDA, viscosimetrico e light scattering.

Gestione dei Dati

Una volta configurata la parte hardware principale del sistema, è necessario considerare le opzioni software per il controllo del sistema e per l'elaborazione dei dati. Con i computer molto potenti di oggi, la calibrazione e i calcoli della distribuzione del peso molecolare possono essere eseguiti in pochi secondi. Il software Empower può essere utilizzato sia per la riduzione dei dati della GPC convenzionale (solo RI), sia per la rivelazione RI/viscometrica. Il software Empower 2 supporta molte procedure di calibrazione, tra cui la calibrazione relativa, la calibrazione cumulativa, la calibrazione con standard polidisperso Hamielec e la calibrazione universale. Sono supportate le interpolazioni su curve da zero a quinto ordine, oltre a una calibrazione limitata sui limiti e a un'interpolazione spline.