Guida alla Cromatografia Liquida per Principianti

Un tubo della colonna e i raccordi devono contenere il materiale di impaccamento cromatografico [fase stazionaria] utilizzato per effettuare la separazione. Devono resistere alla contro-pressione creatasi sia durante la fabbricazione che durante l’uso. Inoltre, devono fornire un circuito idraulico ben controllato [senza perdite, a volume minimo e a volume morto zero] per l’ingresso del campione e l’uscita delle bande degli analiti, così come essere chimicamente inerti rispetto al sistema di separazione [campione, fase mobile e stazionaria]. La maggior parte delle colonne è in acciaio inossidabile per la massima resistenza alla pressione. Il PEEK [un tipo di plastica ingegnerizzata] e il vetro, sebbene meno tolleranti alla pressione, possono essere utilizzati quando sono necessarie superfici inerti per applicazioni chimiche o biologiche specifiche. [Figura M-1].

Una colonna con parete di vetro offre un vantaggio visivo. Nell’immagine rappresentata nella Figura M-2 il flusso è stato interrotto mentre le bande di campione si trovano ancora nella colonna. È possibile notare che i tre coloranti della miscela di campioni iniettata si sono già separati nel letto; l’analita giallo, che si sposta più velocemente, sta per uscire dalla colonna.

Prestazioni di Separazione, Risoluzione

Il grado di separazione tra due composti è definito risoluzione cromatografica [RS]. I due fattori principali che determinano la risoluzione o la forza di separazione complessiva ottenibile da una colonna HPLC sono i seguenti: la forza di separazione meccanica, creata dalla lunghezza della colonna, dalla dimensione delle particelle e dall’uniformità del letto impaccato, e la forza di separazione chimica, creata dalla competizione fisico-chimica per i composti tra il materiale di impaccamento e la fase mobile. L’efficienza è una misura della forza di separazione meccanica, mentre la selettività è una misura della forza di separazione chimica.

Forza di Separazione Meccanica, Efficienza

Se il letto di una colonna è stabile e impaccato in modo uniforme, la sua forza di separazione meccanica è determinata dalla lunghezza della colonna e dalla dimensione delle particelle. La forza di separazione meccanica, nota anche come efficienza, viene spesso misurata e confrontata con un numero di piastre [simbolo = N]. I letti cromatografici con particelle più piccole hanno efficienza e contro-pressione più elevate. Per una data dimensione delle particelle, una maggiore forza di separazione meccanica si ottiene aumentando la lunghezza della colonna; tuttavia, comporterà tempi di analisi cromatografica più lunghi, maggiore consumo di solvente e contro-pressione più elevata. Colonne di lunghezze inferiori riducono al minimo tutte queste variabili, ma riducono anche la forza di separazione meccanica, come mostrato nella Figura N.

Per una data composizione chimica delle particelle, fase mobile e velocità di flusso, come mostrato nella Figura O, una colonna avente la stessa lunghezza e diametro interno, ma con una dimensione inferiore delle particelle, fornirà al contempo una maggiore forza di separazione meccanica. Tuttavia, la relativa contro-pressione sarà molto più elevata.

Forza di Separazione Chimica, Selettività

La scelta di una combinazione di composizione chimica delle particelle [fase stazionaria] e in fase mobile (il sistema di separazione) determinerà il grado della forza di separazione chimica [come si modifica la velocità di ciascun analita]. L’ottimizzazione della selettività è il mezzo più efficace per creare una separazione; può evitare la necessità della forza bruta della massima efficienza meccanica possibile. Per creare una separazione di due composti specificati, uno scienziato può scegliere tra una molteplicità di combinazioni di fase [fase stazionaria e fase mobile] e meccanismi di ritenzione [modalità della cromatografia], che vengono trattate nella sezione successiva.