Guida all’UPLC per Principianti

Comprendendo i principi cromatografici descritti in questo manuale di base e il relativo metodo di applicazione, diventa evidente che per massimizzare le prestazioni di separazione non bastano soltanto particelle di piccole dimensioni e una pressione più elevata. Per ottenere il vantaggio cromatografico delle colonne con particelle di dimensioni inferiori a 2 µm, è necessario utilizzare queste colonne con uno strumento progettato specificamente per sopportare le pressioni prodotte da particelle più piccole e ridurre al minimo l’allargamento di banda. Lo stesso non può essere ottenuto con i sistemi HPLC convenzionali.

Il sistema ACQUITY UltraPerformance LC è una soluzione a progettazione olistica che migliora le prestazioni e la qualità dei dati analitici delle separazioni cromatografiche tenendo conto di tutti gli aspetti dello strumento e della progettazione della colonna.

Ora dovrebbe essere chiaro che la chiave delle separazioni UPLC è la combinazione dello strumento e delle prestazioni della colonna, che consente ai chimici analitici di realizzare e sfruttare appieno la potenza delle colonne con particelle di dimensioni inferiori a 2 µm. Per farlo, si deve ridurre al minimo l’allargamento di banda all’interno [intra-colonna] e all’esterno [extra-colonna] della colonna, ed essere in grado di funzionare alle velocità lineari [e alle pressioni] ottimali di queste colonne con particelle di piccole dimensioni [Figura 51].

Massimizzazione del Potere di Separazione

Per massimizzare il potere di separazione, è possibile combinare l’uso di particelle piccole con temperature e pressioni elevate per sviluppare separazioni ad altissima efficienza utilizzando la tecnologia UPLC.

La Figura 52A rappresenta una colonna UPLC singola da 1,7 µm e lunga 150 mm che produce poco meno di 40 000 piatti a 90 °C. È stata aggiunta una seconda colonna in serie per ottenere una lunghezza di 300 mm, con conseguenti 83 000 piatti teorici [Figura 52B]. L’intero intervallo di pressione del sistema ACQUITY UPLC viene sfruttato aggiungendo una terza colonna in serie, ottenendo così una colonna UPLC lunga 450 mm e impaccata con particelle da 1,7 µm. Come osservato nella Figura 52C, si ottiene un’efficienza di 121 000 piatti in soli 8 minuti.

Anche il potere di separazione in gradiente può essere incrementato applicando la stessa logica. In questo esempio, due colonne UPLC da 1,7 µm e lunghe 150 mm [lunghezza totale 300 mm] sono state collegate in serie per migliorare notevolmente le informazioni ottenute per l’identificazione dei metaboliti [Figura 53]. Nel tempo di analisi di un’ora è stata raggiunta una Peak Capacity superiore a 1000. La capacità di caratterizzare completamente questo campione di urina consente l’identificazione dei metaboliti dei farmaci candidati, la rivelazione e l’identificazione di marker di tossicità e la rivelazione di tossine nel monitoraggio di farmaci terapeutici. In questo caso, il potere di risoluzione, e quindi la qualità spettrale di massa, risulta nettamente migliore, con conseguente semplificazione dell’analisi dei dati, miglioramento dei limiti di rivelazione e maggiore affidabilità del saggio.

Un Unico Sistema per le Separazioni HPLC e UPLC

Il sistema ACQUITY UPLC è progettato per far fronte alle crescenti difficoltà aziendali di immettere i prodotti sul mercato in modo più rapido, mantenendo o migliorando la qualità delle informazioni. Dal 2004, innumerevoli aziende hanno adottato la tecnologia UPLC come platform analitica di routine sostituendo l’HPLC convenzionale.

Quando si adotta una nuova tecnologia è importante prendere in considerazione le relative funzionalità al fine di rispondere alle esigenze attuali e future. Grazie alla tecnologia UPLC, è possibile investire nel futuro utilizzando un unico sistema in grado di eseguire in modo ottimale analisi su colonne con particelle inferiori a 2 μm con la resistenza e la robustezza di eseguire analisi con i metodi HPLC esistenti. Significa che è possibile utilizzare un’unica platform tecnologica indipendentemente dalle esigenze separative, migliorando così la produttività e semplificando il trasferimento dei metodi da un sito all’altro.

La Figura 54 mostra un esempio della possibilità di eseguire il sistema ACQUITY UPLC come HPLC standard. Si tratta del metodo USP per l’Excedrin [antidolorifico da banco] eseguito su un sistema HPLC convenzionale [Figura 54A] e su un sistema ACQUITY UPLC [Figura 54B]. Il metodo cromatografico, le fasi mobili, il campione e la colonna sono stati semplicemente spostati da uno strumento all’altro. Grazie alla progettazione ottimale del sistema, si osservano maggiore efficienza e sensibilità per lo stesso saggio sul sistema ACQUITY UPLC senza modifiche alla selettività o alla ritenzione relativa.

Conclusione

Questo manuale di base sulla tecnologia è stato ideato per fornire al lettore alcune nozioni fondamentali sui principi cromatografici su cui si basa la tecnologia UPLC. Ci auguriamo che il lettore ora comprenda i miglioramenti significativi in termini di risoluzione, sensibilità e velocità che si possono ottenere per le separazioni cromatografiche riducendo al minimo il contributo all’allargamento di banda sia dello strumento che della colonna. Oltre all’allargamento di banda minimo, tale sistema deve essere in grado di funzionare alla velocità lineare [e pressione] ottimale per colonne con particelle di piccole dimensioni [inferiori a 2 µm]. Il sistema ACQUITY UPLC è stato progettato per soddisfare le esigenze presenti e future degli scienziati che si occupano di separazione.

I guadagni teorici in termini di efficienza e risoluzione descritti in questo manuale di base sono stati previsti decenni fa. Nel 2004, la teoria è stata messa in pratica su scala commerciale per la prima volta grazie all’introduzione del sistema ACQUITY UPLC. Da allora, migliaia di scienziati addetti alla separazione in tutto il mondo hanno implementato la tecnologia UPLC e i vantaggi pratici che può offrire alla loro azienda. Il sistema ACQUITY UPLC consente alle aziende di gestire le risorse aziendali in modo più efficace, migliorando la qualità delle informazioni cromatografiche e riducendo il tempo necessario per acquisirle. In questo modo la produttività aziendale aumenta, superando molte delle sfide e dei colli di bottiglia presenti nei laboratori che si occupano di separazione analitica. Oltre a consentire un risparmio evidente e significativo sui materiali di consumo, separazioni più brevi e affidabili sono vantaggiose anche per l’ambiente in quanto richiedono quantità notevolmente inferiori di solventi organici. 

È interessante notare che la maggior parte dei principali produttori di strumentazione, che originariamente aveva sminuito l’importanza di un sistema cromatografico con capacità di pressione più elevata [citando preoccupazioni in termini di sicurezza, robustezza, compatibilità dei campioni, ecc.], ora ha validato la necessità di tale platform LC sviluppando vari sistemi specifici in grado di resistere a pressioni maggiori. Anche se questi sistemi presentano una buona dose di compromessi [per esempio limiti di pressione inferiori, ampio allargamento di banda, scelte di rivelazione limitate, ecc.], questa tendenza inequivocabile verso un rendimento cromatografico più elevato indica che la scienza della separazione sta ancora progredendo.

Riferimenti per Ulteriori Letture:

1. U.D. Neue, “HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice”, Wiley-VCH [1997]
2. J.C. Aresenault and P.D. McDonald, “Beginners Guide to Liquid Chromatography”, Waters [2009]
3. P.D. McDonald, “The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology”, Waters [2009]
4. M.P. Balogh, “The Mass Spectrometry Primer”, Waters [2009]