Caratterizzazione degli spettri prodotti dal desorbimento e dalla ionizzazione soft
Le reazioni retro-Diehls-Alder e l’energia emolitica/eterolitica necessaria per dissociare, o scindere, legami che portano a una frammentazione specifica e ben caratterizzata, continuano a essere la base del nostro pensiero di fronte agli spettri di massa. L’aspetto difficile della MS sta spesso nel rispondere alla domanda posta da Fred W. McLafferty, uno dei contributori importanti alla nostra comprensione delle regole di interpretazione: “Qual è la massa con cui abbiamo a che fare?”
Fino allo sviluppo di tecniche di desorbimento come la ionizzazione per desorbimento laser assistita da matrice (MALDI) e l’elettronebulizzazione, almeno a volte la risposta a questa domanda sembrava più facile. La facilità di esecuzione dipendeva dalla necessità o meno di derivatizzare il campione per renderlo volatile e suscettibile di analisi GC-MS. In questo caso spesso gli spettri sarebbero dominati dai gruppi derivatizzati e mostrerebbero poco o nessun ione molecolare (da qui la necessità di CI). In tal caso l’avvento dell’elettronebulizzazione e dell’APCI hanno sicuramente facilitato l’identificazione del peso molecolare di piccole specie a carica singola. Almeno in questi casi la MS trattava il valore m/z degli ioni che mostravano solo una singola carica. La massa di un analita in genere è indicata come massa nominale (il valore nominale m/z) dello ione molecolare, la stessa massa nominale della molecola. La massa nominale di uno ione, di una molecola o di un radicale è la somma delle masse nominali degli elementi nella sua composizione elementare. La massa nominale di un elemento è la massa intera dell’isotopo stabile più abbondante in natura.
Ma la risposta è diventata più elusiva quando le tecniche di desorbimento a ionizzazione soft come la ionizzazione per elettronebulizzazione (ESI) si sono diffuse sul mercato all’inizio degli anni ’90. Nell’età “pre-desorbimento” della MS, la massa nominale della maggior parte degli analiti interrogati dalla MS era inferiore a 500 Da. Il difetto di massa dovuto alla presenza di idrogeno non costituiva un problema per questi analiti. Il limite massimo di m/z per la maggior parte degli spettrometri di massa è compreso nell’intervallo 650-800. Pertanto, in quel periodo di ionizzazione pre-desorbimento, la massa nominale e la massa monoisotopica intera avevano lo stesso valore. La massa monoisotopica di uno ione, di una molecola o di un radicale è la somma delle masse monoisotopiche degli elementi della sua composizione elementare. La massa monoisotopica di un elemento è la massa esatta dell’isotopo stabile più abbondante in natura.
All’inizio dell’era della ionizzazione per desorbimento, le molecole più grandi e una maggiore precisione sono diventate parte integrante degli studi perché la tecnologia lo consentiva con poche difficoltà. Solo allora il problema del difetto di massa è diventato così importante. In uno spettrometro di massa in grado di generare report solo in base al valore m/z intero più vicino, lo ione molecolare di un composto C50H102 potrebbe essere rappresentato da un picco a m/z 703 anziché a m/z 702 perché lo ione molecolare avrebbe una massa monoisotopica pari a 702,7825, che viene arrotondata all’intero 703.
Al di sopra di 500 Da, il difetto di massa può rappresentare un problema serio nella determinazione dei valori m/z dei picchi MS. È importante tenere presente che lo spettrometro di massa misura le intensità dei segnali che si verificano in un momento specifico durante la raccolta dello spettro di massa, indipendentemente dal tipo di analizzatore m/z utilizzato. Il valore m/z riportato è una funzione del tempo impiegato dagli ioni di un valore m/z noto prodotti da un composto specifico, rispetto al composto di calibrazione, per raggiungere il rivelatore.
Poiché la massa degli ioni monoisotopici cambia al variare della posizione sulla scala m/z, lo spettrometro di massa che riporta valori m/z interi può effettivamente eseguire misurazioni ogni 0,05 unità m/z. L’intensità rivelata può essere quella all’apice del picco spettrale di massa o la somma delle intensità attraverso il picco spettrale di massa. Il valore m/z riportato è un numero intero ottenuto arrotondando il valore m/z osservato per il picco spettrale di massa massimo.
La MS a ionizzazione elettronica spesso si basa su composti perfluorurati come la perfluorotributilammina (massa molecolare nominale 671) per calibrare la scala m/z. Questo accade perché la massa intera di uno ione è pressoché identica alla sua massa monoisotopica. Una volta che uno ione supera una massa nominale di 1000 Da, non si osservano picchi di valore nominale m/z nello spettro di massa. Il picco di massa monoisotopica è compensato di una quantità pari al difetto di massa dello ione rispetto al punto in cui dovrebbe essere osservato il picco di massa nominale. Per ioni a carica singola con massa superiore a 500 Da, utilizzando tecniche come l’elettronebulizzazione con quadrupolo di trasmissione o spettrometri di massa a dispositivo di intercettazione ionico a quadrupolo che hanno risoluzione unitaria su tutta la scala m/z, i picchi isotopi saranno separati chiaramente.
Tra le molte discussioni sul ruolo degli isotopi nella determinazione dell’identità di un composto, una è apparsa su LCGC Europe che contribuisce a fornire un utile bilanciamento. “Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC-MS” (L.M. Hill, LCGC Europe 19(4), 226-238 (2006) si basa su un lavoro di intercettazione ionica a bassa risoluzione. In una parte pertinente, l’autore mette in guardia contro l’eccessiva sicurezza quando si utilizzano i dispositivi di intercettazione ionica: “Chi utilizza dispositivi di intercettazione dovrà essere più attento rispetto a chi usa sistemi QToF o a triplo quadrupolo. È ovviamente necessario iniziare con il picco dell’isotopo +1 isolato e privo di contaminazione . . . i dispositivi di intercettazione tendono a intercettare con una risoluzione inferiore rispetto a quella di scansione . . . svuotare il dispositivo di intercettazione . . . in ordine di massa.” Ciò non significa che i dispositivi di intercettazione ionica non possano essere utilizzati ma, come tutti gli strumenti, devono essere applicati tenendo presenti le loro capacità e i loro limiti.
Allo stesso modo uno strumento in grado di fornire una risoluzione molto elevata non fornisce automaticamente la risposta corretta. Una serie di dati presentati in un articolo di Kind e Fiehn-T. Kind e O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234 (2006) è particolarmente sorprendente e ha portato alla loro conclusione, che hanno basato sull’esame di 1,6 milioni di risultati di ricerca della formula: “L’alta precisione di massa (1 ppm) e l’alto potere risolutivo da soli [non] sono sufficienti. . . solo un filtro di abbondanza isotopica [è] in grado di ridurre il numero di formule molecolari candidate.” Gli spettrometri di massa in grado di fornire solo un’accuratezza di massa di 3 ppm, ma un’accuratezza del modello isotopico del 2%, rimuovono in genere più del 95% dei falsi candidati. Queste prestazioni supererebbero anche gli spettrometri di massa in grado di generare 0,1 ppm, se tali strumenti esistessero effettivamente, che non sono dotati di capacità di pattern isotopico.
Tra masse di 150 Da e 900 Da, il numero di possibili formule elencate come accuratezza di massa è aumentato da 10 ppm a 0,1 ppm senza l’ausilio di informazioni sull’abbondanza degli isotopi: da un minimo di 2 formule candidate a 150 Da a 3447 a 900 Da per 10 ppm. Anche all’estremità superiore (900 Da), la sola accuratezza di massa a 1 ppm fornisce 345 candidati. Invocando l’accuratezza dell’abbondanza isotopica del 2%, il numero di candidati a 900 Da si riduce a un opportuno 18. Essi mostrano anche che consentendo una scarsa accuratezza del 5% per l’acquisizione degli isotopi associati a una precisione di 5 ppm si ottengono 196 candidati.
