Manuale di Base sulla Cromatografia Liquida Preparativa

Dopo che un metodo di separazione è stato sviluppato e sottoposto allo scale-up desiderato, il passaggio finale consiste nell’isolare o raccogliere il composto di interesse. Le frazioni possono essere raccolte manualmente dall’operatore mentre viene monitorata l’eluizione dei picchi oppure la raccolta delle frazioni può essere automatizzata in base al segnale del rivelatore o al tempo di ritenzione.

Tempo di Arrivo della Frazione

Le frazioni vengono raccolte quando il rivelatore rivela un picco che soddisfa i criteri di attivazione della raccolta definiti dall’utilizzatore. Quando il picco è presente nel rivelatore, non ha ancora raggiunto il raccoglitore di frazioni. Se un raccoglitore di frazioni si attiva troppo presto non rivela il picco. Per sincronizzare correttamente il tempo di raccolta delle frazioni, è necessario determinare in anticipo un tempo di ritardo delle frazioni specifico per il sistema. Un metodo di calibrazione prevede l’iniezione di un colorante concentrato e il confronto tra il tempo necessario per essere visto dal rivelatore e il tempo necessario per raggiungere il raccoglitore di frazioni. In genere, la calibrazione del tempo di arrivo della frazione è un processo una tantum e, una volta inserito nel software, può essere ricalcolato per qualsiasi velocità di flusso. Il tempo di arrivo della frazione deve essere ricalibrato quando si apportano modifiche al circuito idraulico tra il rivelatore e il raccoglitore di frazioni, per esempio quando si aggiunge un divisore di flusso.

Gestione della Raccolta delle Frazioni

La raccolta manuale è abbastanza semplice e diretta. L’utilizzatore attiva la commutazione della valvola di deviazione sul raccoglitore di frazioni mentre l’eluizione del composto viene monitorata visivamente attraverso un grafico del segnale in tempo reale del software dello strumento online. La raccolta manuale delle frazioni offre la massima flessibilità poiché vengono raccolte solo le parti desiderate dell’analisi di purificazione, ma la produttività tende a essere bassa a causa della mancanza di automazione.

Raccolta delle Frazioni Basata sui Picchi

L’attivazione basata sui picchi è un modo automatizzato di raccogliere le frazioni in base a un segnale del rivelatore. I parametri utilizzati per decidere se un picco del cromatogramma deve attivare il raccoglitore di frazioni sono in genere la pendenza, la soglia e/o l’altezza del picco.

L’approccio più comune per la raccolta delle frazioni basata sui picchi si basa sull’altezza o sulla soglia. La raccolta delle frazioni si avvia appena un segnale raggiunge un’altezza predefinita del rivelatore. Quando il segnale scende al di sotto di un’altezza predefinita, la raccolta si interrompe.

La raccolta delle frazioni in base alla pendenza spesso è un metodo di raccolta più complesso, ma può essere utilizzata per raccogliere i picchi non separati dalla linea di base. Quando si raccoglie in base alla pendenza, la raccolta delle frazioni viene attivata automaticamente dal software in corrispondenza dei punti di flesso matematici rivelati lungo la derivata prima del cromatogramma.

Raccolta delle Frazioni per Rivelazione di Massa

Nella raccolta delle frazioni basata sulla massa, vengono raccolti soltanto i composti aventi la massa desiderata definita dall’utilizzatore. Di conseguenza, la raccolta in base alla massa può essere più efficiente della raccolta basata sui picchi. I requisiti per la raccolta delle frazioni basata sulla massa sono riassunti qui di seguito:

• La massa molecolare del composto deve essere nota.
• Il composto deve ionizzare per la rivelazione di massa.

Analisi delle Frazioni

Una volta raccolte, le frazioni possono essere analizzate direttamente nel recipiente di raccolta oppure è possibile rimuovere il solvente per ottenere il prodotto purificato. Può essere utilizzato un evaporatore rotante (rotavap) per portare la frazione a secco. Con questo strumento, il solvente evapora dal campione e la parte acquosa viene liofilizzata. Se sono stati utilizzati tamponi inorganici o se la parte acquosa è particolarmente elevata, la frazione può essere fatta passare attraverso una cartuccia SPE in fase inversa per intercettare i composti target (cioè la cosiddetta desalinizzazione). I composti intercettati vengono quindi eluiti con una piccola quantità di solvente organico, che può evaporare più facilmente.

Una stima del recupero può essere determinata tramite l’analisi delle frazioni utilizzando varie tecniche analitiche di routine come: UV, IR, MS, NMR, raggi X, saggio e/o determinazione strutturale. Quando è disponibile uno standard, è facile condurre un confronto diretto dell’isolato con i dati di letteratura, tuttavia se il composto target è incognito, è necessario un approccio sistematico ampio e completo che coinvolga una serie di tecniche fisiche, chimiche e spettroscopiche per stabilire un profilo di purezza e stabilità.

Equazione 14: % di recupero

Quando si analizza l’isolato, se la purezza, il recupero o l’attività non sono quelli previsti, valutare le seguenti situazioni:

• Quando si esegue il test direttamente dal recipiente di raccolta, si possono formare gradienti di concentrazione. Di conseguenza, il risultato della purezza dipende dal punto di prelievo del campione nel recipiente di raccolta. Per ottenere un risultato rappresentativo, i campioni devono essere miscelati bene prima dell’analisi.
• Se il campione è più solubile in un solvente forte come il DMSO, ma non in fase mobile, la frazione raccolta cristallizzerà durante il periodo di conservazione nel recipiente di raccolta. Se si preleva la fase liquida per l’analisi di purezza e concentrazione, i risultati saranno rappresentativi solo della parte solubile.
• Il composto attivo può andare perso anche a causa della decomposizione tra il momento della raccolta, il test di purezza e il test di attività. Può anche decomporsi durante il processo di essiccazione. Pertanto, il test di attività viene quasi sempre eseguito prima e dopo l’essiccazione.
• Il composto attivo è stato trattenuto nella colonna.
• Il composto attivo è instabile alle condizioni utilizzate nel processo di isolamento.
• La soluzione di estrazione potrebbe non essere stata preparata in un solvente compatibile con la fase mobile, pertanto potrebbe essersi verificata una precipitazione.
• La maggior parte del composto attivo si distribuisce su un’ampia gamma di frazioni, provocando quantità non rivelabili del composto presente nelle frazioni.
• L’attività dell’estratto potrebbe essere dovuta alla presenza di altri composti nel campione grezzo senza attività individuale.
• L’isolato potrebbe non essere puro come previsto se è stato raccolto a una lunghezza d’onda UV in cui non sono state assorbite le impurezze a eluizione ravvicinata.

Se l’isolato non rientra nei requisiti applicativi di purezza, produttività o recupero, è possibile eseguire una nuova purificazione dell’isolato utilizzando lo stesso metodo di separazione oppure sviluppare un nuovo metodo di separazione globale con selettività di colonna diversa. L’analista ha il compito di determinare il tempo e lo sforzo da dedicare alla purificazione al fine di raggiungere gli obiettivi di purezza, produttività e recupero desiderati.