Primer sulla Spettrometria di Massa

L’aumento dell’accuratezza e della risoluzione della massa misurata è ora uno strumento dominante per la caratterizzazione strutturale in varie applicazioni, oltre alla scoperta precoce dei principi attivi. Con la loro ampia specificità e utilità, gli strumenti a quadrupolo a tempo di volo (QToF), oggi proposti da numerosi produttori, stanno sostituendo altre tecnologie LCMS.

Anche se esistono strumenti di ordine superiore, l’elevata accuratezza di massa di uno strumento QToF rientra nell’intervallo di poche parti per milione del valore reale, calcolato, monoisotopico; inoltre, la sua alta risoluzione, fino a 10 volte superiore a quella di uno strumento a quadrupolo, ci consente di determinare formule empiriche in base al difetto di massa (in cui il valore della massa critica dell’idrogeno e degli altri atomi presenti funge da elemento di differenziazione). L’analisi di speciazione, per esempio la distinzione tra un’aldeide e un solfuro, diventa possibile con un aumento dell’accuratezza di massa al di sopra dei limiti del quadrupolo, fino a 30 ppm, in cui le due masse differiscono di 0,035 Da. La differenziazione tra i processi metabolici che coinvolgono la metilazione è, tuttavia, più impegnativa. L’aggiunta di CH₂ produce un aumento rispetto al precursore (risposta per il solo principio attivo) nella massa misurata di +14,0157 Da, rispetto a una biotrasformazione in due fasi che implica idrossilazione (aggiunta di ossigeno) seguita da ossidazione in corrispondenza di un doppio legame (perdita di H₂), che produce un aumento di +13,9792 Da. Tuttavia entrambe le misure, se limitate dalla risoluzione nominale, una risposta tipica del quadrupolo, assomiglieranno a +14 Da.

Elevata accuratezza di massa e bassa risoluzione

Gli strumenti a quadrupolo a bassa risoluzione offrono buone prestazioni per misure di accuratezza di massa estremamente elevate, come quelle utilizzate per l’analisi delle proteine. Le masse di proteine sono generalmente definite come valori “medi” quando i picchi degli isotopi non sono risolti l’uno rispetto all’altro. La massa media è la media ponderata di tutte le specie isotopiche in una molecola. La risoluzione strumentale normalmente impiegata negli strumenti a quadrupolo amplia la risposta risolta per una proteina da 10 kDa di un fattore di x1,27. Tale fattore aumenta in modo significativo all’aumentare della massa (per esempio, fino a x2,65 a 100 kDa). Tuttavia, riducendo l’ampiezza del picco a m/z 0,25 (aumentando la risoluzione a 4000) anziché limitare la risoluzione dello strumento a 1000 utilizzando l’ampiezza tipica del picco (m/z 0,6), la situazione migliora in modo significativo.

In pratica, le analisi ESI-MS di grandi molecole producono ioni a carica multipla. Pertanto, le larghezze devono essere divise per il numero di cariche su uno ione per ottenere l’ampiezza sulla scala del rapporto massa-carica. Per esempio, una proteina da 20 kDa con 10 o 20 cariche produrrà inviluppi isotopici di ampiezza pari a 0,9 o 0,45 m/z a m/z ~2000 o ~1000 rispettivamente.

Quando questi ioni vengono osservati su un set di strumenti per una risoluzione significativamente inferiore a quella necessaria per risolvere gli isotopi (per esempio, una risoluzione inferiore a 10 000), viene prodotto un singolo picco per ciascuno stato della carica. L’ampiezza complessiva viene determinata combinando l’ampiezza del picco strumentale con l’ampiezza teorica dell’inviluppo isotopico divisa per il numero di cariche sullo ione. L’ampiezza del picco strumentale sarebbe determinata sul primo picco isotopico di un composto a basso peso molecolare allo stesso valore m/z del picco proteico a carica multipla.

Quanta accuratezza è necessaria, o si può realisticamente raggiungere, e quali sono i compromessi?

Considerare i requisiti per una caratterizzazione univoca tratti dalle linee guida dell’autore del Journal of the American Society for Mass Spectrometry (marzo 2004). Per le composizioni C, H, O, N (C_0-100, H_3-74, O_0-4 e N_0-4) una risposta nominale massa-carica a 118 richiede solo un errore non superiore a 34 ppm per essere univoca, dove una risposta m/z a 750 richiede una precisione migliore di 0,018 ppm per eliminare “tutte le possibilità estranee”.

Confronto della precisione da strumento a strumento: unità in millimassa (mmu), errore di misura (ppm) e risoluzione

Secondo la Accurate Mass Best Practice Guide del programma VIMMS, un’iniziativa che fa parte del sistema di misurazione nazionale del Regno Unito, la maggior parte degli strumenti utilizzati per misurazioni di massa accurate è in grado di raggiungere una precisione pari o superiore a 10 ppm.

Una massa calcolata di 118 Da misurata da un moderno spettrometro di massa con un’accuratezza di 2 mmu mostrerebbe un errore di 17 ppm, sufficiente per gli standard odierni per la determinazione univoca di una formula chimica di tale massa:

Massa esatta calcolata monoisotopica = 118 Da

Massa accurata misurata = 118,002 Da

Differenza = 0,002 mmu

Errore [Differenza/massa esatta x 106] = 17 ppm

Uno strumento in grado di fornire una risposta a 750 m/z,, anch’essa carente di 2 mmu, avrebbe una precisione pari a 2,7 ppm. Nel primo caso, secondo gli standard pubblicati dal Journal of The American Society for Mass Spectrometry, la misura è più che sufficiente per l’identificazione univoca di una formula chimica. Ma, in quest’ultimo caso, la misurazione non è sufficientemente precisa. Solo la spettrometria di massa a risonanza ionica ciclotronica a trasformata di Fourier (FTICR) di ordine più alto può raggiungere tale precisione a masse più elevate.

Un metodo esaustivo per la valutazione della capacità di misurazione di massa accurata degli strumenti che richiama l’uso previsto è il calcolo del valore quadratico medio o errore RMS. Per illustrarne l’utilizzo, quanto segue è un adattamento delle specifiche di accuratezza di misura di massa di uno spettrometro di massa ToF in commercio.

“L’accuratezza della misurazione della massa dello strumento, in normali condizioni operative, sarà migliore di un dato valore ppm RMS su un intervallo m/z dato, in base a un numero di misurazioni ripetute consecutive di un picco dell’analita (di un dato valore m/z), utilizzando un picco di riferimento adatta (di un dato valore m/z). I picchi dell’analita e di riferimento devono avere un’intensità sufficiente ed essere privi di interferenze da parte di altre masse.”

Ci sono alcuni punti importanti e presupposti da considerare:

1. È già stata eseguita una calibrazione dello strumento con picchi di massa nota utilizzando uno standard di calibrazione. Il picco di riferimento viene utilizzato per tenere conto di eventuali variazioni della calibrazione dello strumento nel tempo e l’accuratezza della misurazione della massa viene determinata utilizzando il picco dell’analita.
2. Normali condizioni operative: possono includere anche dettagli sulle condizioni cromatografiche (per le specifiche delle prestazioni LC-MS) ed eventuali condizioni operative MS correlate (per esempio risoluzione della massa, m/z di interesse o velocità di scansionamento spettrale).
3. Intensità sufficiente: si presuppone che il conteggio ionico non sia dannoso per la caratterizzazione della precisione e dell’accuratezza (misurazione di massa) dello strumento in questione. Un numero insufficiente di ioni comporta scarse statistiche relative agli ioni e un numero eccessivo di ioni può portare alla saturazione del rivelatore; entrambe le cose si traducono in una variazione maggiore nella deviazione standard delle misurazioni ripetute e incidono negativamente sul calcolo dell’errore RMS (rilevante anche per la calibrazione dello strumento).
4. Privi di interferenze: si presuppone che la misurazione della massa del picco di massa nota sia priva di interferenze da parte di ioni di massa identica o simile. La sovrapposizione dei picchi comporta una scarsa accuratezza delle misure di massa, che è anche dannosa per la caratterizzazione adeguata dell’accuratezza o della precisione dello strumento (rilevante anche per la calibrazione dello strumento).
5. Il riferimento è una buona rappresentazione dell’intervallo m/z rilevante per l’analisi di un particolare tipo di campione.

L’errore RMS viene calcolato utilizzando la seguente relazione, in cui E_ppm è l’errore ppm e n è il numero di masse considerate:

È opportuno notare che l’errore RMS consente ad alcune misurazioni di non rientrare nella “finestra di interesse” dell’errore ppm (per esempio, 5 ppm RMS). Per garantire la qualità delle misurazioni, devono essere soddisfatte le condizioni sopra descritte (in particolare per quanto riguarda l’intensità e l’influenza delle interferenze, statistiche ioniche bilanciate con chiara definizione dei picchi negli spettri) su una serie di iniezioni ripetute. Molti numeri di risoluzione e accuratezza di massa segnalati non sono numeri di errore RMS, ma hanno origine da un singolo ione selezionato (favorevole).

In tutte le applicazioni è importante ricordare che un segnale debole (risoluzione eccessivamente alta) può produrre statistiche relative agli ioni scarse e può quindi essere inutilizzabile. Un segnale troppo forte può essere ugualmente inutile, poiché causa la saturazione del rivelatore. L’obiettivo è ottenere statistiche ioniche con un equilibrio e una definizione degli spettri ideali.

Alcuni confronti con riferimento alla figura:

• la risoluzione del quadrupolo non è sufficiente a differenziare i due composti nella figura in alto.
• con un potere di risoluzione di ~5000, i dati ToF mostrano chiaramente due picchi distinti, la cui massa può essere misurata con precisione fino a < 5 ppm.

È importante valutare i vari ruoli interconnessi giocati nella precisione della massa accurata dallo spostamento tra le definizioni di massa e l’aumento della risoluzione e fattori quali la forma del picco e la necessità di calibrazione. Se questi non sono chiaramente compresi e presi in considerazione, si possono verificare errori di assegnazione di massa e altri risultati indesiderati.

I due frammenti di diversa composizione nella figura provengono dallo stesso analita e quindi si trovano contemporaneamente nella sorgente. Anche la migliore cromatografia in questo caso non è di aiuto, quindi questo sottolinea uno dei motivi per cui una risoluzione più elevata è utile in particolare nell’analisi di incognite. Ciò si applica ugualmente bene ai dati degli ioni prodotto QTof rispetto ai dati degli ioni prodotto da un triplo quadrupolo. Come ulteriore vantaggio offerto da questo grado di risoluzione più elevato, il grafico della corrente ionica estratta (XIC) di ciascuno di essi consente di differenziare selettivamente gli analiti contenenti ossigeno e gli analiti alchilici rispetto ai cromatogrammi in cui i dati provenienti da quadrupolo mancherebbero di questa capacità.

Vedere MS - The Preparation Art, LCGC

• Debating Resolution and Mass Accuracy, Vol. 22 N. 2, 118-130, febbraio 2004
  • Perché è importante: si occupa di molti dei problemi al centro degli aspetti pratici dell’uso, nonché dei confronti, da fonti del settore
    
• Petroleomics: MS from the ocean floor, Vol. 26, N. 3, marzo 2008
  • Perché è importante: analizza l’utilità degli strumenti a risoluzione più elevata e li confronta con aspettative realistiche.

Inoltre:

• Methodology for Accurate Mass Measurement of Small Molecules, K. Webb, T. Bristow, M. Sargent, B. Stein, Department of Trade and Industry’s VIMMS Program within the UK National Measurement System, (LGC Limited, Teddington, UK 2004). Documento orientativo VIMMS 2004
  • Perché è importante: una panoramica breve e concisa dei problemi critici per il successo di un lavoro di massa misurato e accurato.
    
• Dealing with the Masses: A Tutorial on Accurate Masses, Mass Uncertainties, and Mass Defects, A. D. Leslie and D. A Volmer, Spectroscopy, Vol. 22, N. 6, giugno 2007
  • Perché è importante: amplia l’argomento di base per includere il difetto di massa di Kendrick e la marcatura per peptidi e proteine.

Sulfametazina massa nominale = 278

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa media – Calcolata utilizzando tutti gli isotopi di ciascun elemento e la loro abbondanza in natura.

Sulfametazina massa media 278,3313

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa esatta calcolata – (monoisotopica). Determinata sommando le masse dei singoli isotopi per un dato ione.

Sulfametazina massa esatta = 278,0837

[C₁₂H₁₄N₄O₂S]

Massa accurata – (in realtà “massa esatta misurata”). Cosa facciamo con i nostri strumenti. È la misura di un valore m/z riportato (in genere) con tre o quattro posizioni decimali.

All’aumentare della massa, aumentano le differenze tra le definizioni, e la forma dei picchi gioca un ruolo importante:

Ubiquitina nominale esatta media

[C₃₇₈H₆₃₀N₁₀₅O₁₁₈S] 8556 8560,6254 8565,8730