Colonne in Fase Inversa per Oligonucleotidi

Colonne in Fase Inversa per Oligonucleotidi

Ottieni una tolleranza di pH e temperatura leader del settore e una risoluzione eccezionale con le colonne in fase inversa Waters per la caratterizzazione degli oligonucleotidi e l’analisi delle impurezze. Ogni lotto di sorbente è sottoposto a test di controllo qualità (QC) con standard oligonucleotidici per garantire prestazioni omogenee e riproducibilità da lotto a lotto.

Ottieni una tolleranza di pH e temperatura leader del settore e una risoluzione eccezionale con le colonne in fase inversa Waters per la caratterizzazione degli oligonucleotidi e l’analisi delle impurezze. Ogni lotto di sorbente è sottoposto a test di controllo qualità (QC) con standard oligonucleotidici per garantire prestazioni omogenee e riproducibilità da lotto a lotto.
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Panoramica

La cromatografia in fase inversa ad accoppiamento ionico (IPRP) è il metodo preferito per la caratterizzazione degli oligonucleotidi di sintesi e l’analisi delle impurezze. Questo metodo aiuta gli scienziati a risolvere le impurezze di sintesi e correlate al processo meglio di qualsiasi altra tecnica cromatografica, inclusi lo scambio anionico (AEX), HILIC e SEC. Tuttavia questa tecnica presenta anche delle sfide. Diversi fattori possono influire direttamente sulle prestazioni di separazione e sulla riproducibilità, tra cui la purezza e la stabilità dei reagenti di accoppiamento ionico, l’adsorbimento non specifico sull’hardware cromatografico e le variazioni da lotto a lotto nel sorbente. L’IPRP si basa su condizioni di pH e di temperatura elevati per ottenere separazioni ottimali e questo richiede che i valori di tolleranza di pH e temperatura dei materiali delle colonne siano elevati.

Con le colonne Waters in fase inversa per oligonucleotidi puoi avere la certezza di raggiungere i risultati desiderati grazie alle caratteristiche seguenti: 

  • Stabilità di pH e temperatura leader del settore con la tecnologia delle particelle ibride di silice BEH C18 per una risoluzione e una durata della colonna eccezionali.
  • Una notevole riduzione dell’adsorbimento non specifico (NSA) con la tecnologia MaxPeak Premier High-Performance Surfaces (HPS) per ottenere i massimi livelli di sensibilità, riproducibilità e produttività.
  • Test di controllo qualità a base di oligonucleotidi per garantire prestazioni e riproducibilità delle separazioni da lotto a lotto.

Sensibilità e riproducibilità migliorate senza condizionamento della colonna

Sensibilità e riproducibilità migliorate senza condizionamento della colonna

Gli acidi nucleici, inclusi gli oligonucleotidi, sono polianionici (a carica negativa) e si adsorbono facilmente sulle superfici degli ossidi metallici nelle colonne in acciaio inossidabile. Le colonne Waters MaxPeak Premier per oligonucleotidi sono dotate di una struttura chimica di superficie ibrida inerte a base di silice organica/inorganica che elimina quasi completamente l’NSA degli acidi nucleici, migliorando la sensibilità, la riproducibilità e la produttività.  Con Waters, il laboratorio può eliminare gli step di passivazione della colonna e di condizionamento dei campioni, che richiedono molto tempo, prima dell’analisi.

Risoluzione eccezionale degli oligonucleotidi di sintesi
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Risoluzione eccezionale degli oligonucleotidi di sintesi
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La cromatografia IP-RP di oligonucleotidi di sintesi risolve i componenti del campione in base a lievi variazioni di dimensioni, carica e idrofobicità. Le colonne Waters ACQUITY (UPLC: dimensione della particella 1,7 µm) e XBridge (HPLC/UHPLC: dimensione della particella 2,5 µm) Premier BEH C18 per oligonucleotidi offrono una risoluzione, una sensibilità e una riproducibilità dei campioni di oligonucleotidi eccezionali.

Durata delle colonne eccezionale

Durata delle colonne eccezionale

Le colonne Waters ACQUITY e XBridge Premier per oligonucleotidi includono particelle di silice ibrida Waters BEH (Ethylene Bridged Hybrid) C18 e hanno una notevole durata in condizioni di pH e temperatura elevati, pur mantenendo prestazioni di separazione eccezionali.

Soluzioni

Colonne da 2,1 x 20 mm per separazioni ultrarapide

Colonne da 2,1 x 20 mm per separazioni ultrarapide
Colonne ACQUITY Premier per oligonucleotidi BEH C18 da 2,1 x 20 mm

Gli oligonucleotidi e gli acidi nucleici più lunghi presentano un forte meccanismo di legame ed eluizione on/off, che li rende sensibili a "gradienti balistici" e separazioni ultraveloci che possono migliorare il rendimento nei laboratori di test ad alta produttività. Le colonne Waters ACQUITY Premier BEH 18 per oligonucleotidi da 2,1 x 20 mm con dimensioni dei pori pari a 130 Å e 300 Å consentono separazioni ultrarapide di oligonucleotidi a mero corto (10-40 nt) e a mero lungo (> 40 nt), rispettivamente.

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Colonne MaxPeak Premier a pori larghi (300 Å) per oligonucleotidi a mero lungo

Colonne MaxPeak Premier a pori larghi (300 Å) per oligonucleotidi a mero lungo
Colonne MaxPeak Premier a porti larghi (300 Å)

Entrambe le colonne ACQUITY (1,7 µm) e XBridge (2,5 µm) Premier per oligonucleotidi sono disponibili con dimensioni dei pori pari a 130 Å e 300 Å che presentano differenze nella capacità di ritenzione e nella nitidezza del picco a seconda della lunghezza dell’oligonucleotide. L’area superficiale più estesa delle particelle con dimensioni dei pori pari a 130 Å consente una ritenzione e una risoluzione maggiori per gli oligonucleotidi a mero corto (< ~40 mer), mentre le particelle con dimensioni dei pori pari a 300 Å consentono una maggiore diffusione e una migliore risoluzione per gli oligonucleotidi più lunghi (> ~40 mer).

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Standard per oligonucleotidi/acidi nucleici per l’analisi comparativa delle prestazioni

Standard per oligonucleotidi/acidi nucleici per l’analisi comparativa delle prestazioni
Standard per Oligonucleotidi e Acidi Nucleici

Waters fornisce una gamma di standard analitici di alta qualità tracciabili per lotto a complemento delle colonne in fase inversa per oligonucleotidi rendendo più semplici i test di system suitability, lo sviluppo di metodi e la risoluzione dei problemi. Questi includono lo standard per oligonucleotidi Waters MassPREP contenente una scala oligodT da 15 a 35 mer per il controllo qualità di tutte le colonne per oligonucleotidici a marchio Waters, uno standard ssDNA a 20 mer per il benchmarking della frammentazione e l’analisi delle sequenze LC-MS/MS, un oligonucleotide antisenso (ASO) fortemente modificato e coniugato con lipidi, scale ssDNA e dsDNA e altro ancora.

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Colonne VanGuard FIT per una maggiore durata della colonna

Colonne VanGuard FIT per una maggiore durata della colonna
Colonna VanGuard FIT

Tutte le colonne ACQUITY e XBridge Premier BEH C18 per oligonucleotidi sono disponibili nel formato colonna VanGuard FIT, che include una cartuccia pre-colonna da 5 mm completamente integrata impaccata con lo stesso sorbente e che funge da protezione per evitare l’incrostazione della colonna analitica. Il design completamente integrato non ha alcun impatto sulla risoluzione del campione. In caso di incrostazioni è possibile sostituire facilmente la cartuccia, prolungando così la durata utile della colonna analitica.

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Applicazioni

Waters ha realizzato più di 30 note applicative relative alla caratterizzazione degli oligonucleotidi e all’analisi delle impurezze utilizzando i nostri strumenti di cromatografia liquida e spettrometria di massa all’avanguardia per scopi terapeutici e diagnostici. I seguenti esempi recenti mettono in evidenza la nostra solida esperienza applicativa e gli strumenti più recenti e avanzati.

Waters ha realizzato più di 30 note applicative relative alla caratterizzazione degli oligonucleotidi e all’analisi delle impurezze utilizzando i nostri strumenti di cromatografia liquida e spettrometria di massa all’avanguardia per scopi terapeutici e diagnostici. I seguenti esempi recenti mettono in evidenza la nostra solida esperienza applicativa e gli strumenti più recenti e avanzati.

Note Applicative

Note Applicative

In quanto RNA a doppio filamento, le terapie a base di oligonucleotidi siRNA (Small Interfering RNA) presentano sfide analitiche uniche. Queste note applicative illustrano sia le separazioni cromatografiche non denaturanti sia quelle denaturanti.

In quanto RNA a doppio filamento, le terapie a base di oligonucleotidi siRNA (Small Interfering RNA) presentano sfide analitiche uniche. Queste note applicative illustrano sia le separazioni cromatografiche non denaturanti sia quelle denaturanti.

Note Applicative

Note Applicative

La sequenza nucleotidica per gli oligonucleotidi diagnostici e terapeutici è fondamentale per la loro specificità e la loro funzione. È quindi essenziale confermarne accuratamente la sequenza. I workflow LC-MS consentono la conferma al 100% della sequenza di oligonucleotidi e offrono la capacità unica di confermare l’identità e la posizione dei nucleotidi modificati nella sequenza, sia per gli oligonucleotidi di sintesi che per quelli generati da una digestione nucleasica di acidi nucleici a catena più lunga (ad esempio, workflow di mappatura degli oligo ssDNA o mRNA).

La sequenza nucleotidica per gli oligonucleotidi diagnostici e terapeutici è fondamentale per la loro specificità e la loro funzione. È quindi essenziale confermarne accuratamente la sequenza. I workflow LC-MS consentono la conferma al 100% della sequenza di oligonucleotidi e offrono la capacità unica di confermare l’identità e la posizione dei nucleotidi modificati nella sequenza, sia per gli oligonucleotidi di sintesi che per quelli generati da una digestione nucleasica di acidi nucleici a catena più lunga (ad esempio, workflow di mappatura degli oligo ssDNA o mRNA).

Note Applicative

Note Applicative

Gli attributi di qualità fondamentali per i vaccini e le terapie a base di mRNA includono la conferma della lunghezza e della polidispersione della coda poliA, nonché dell’identità del cappuccio da 5’ ed eventuali varianti di basso livello presenti. Queste note applicative illustrano queste analisi tramite cromatografia in fase inversa a coppia ionica.

Gli attributi di qualità fondamentali per i vaccini e le terapie a base di mRNA includono la conferma della lunghezza e della polidispersione della coda poliA, nonché dell’identità del cappuccio da 5’ ed eventuali varianti di basso livello presenti. Queste note applicative illustrano queste analisi tramite cromatografia in fase inversa a coppia ionica.

Note Applicative

Note Applicative

Durante lo sviluppo di farmaci, dalla scoperta iniziale fino allo sviluppo in fase avanzata, è necessario un adeguato materiale oligonucleotidico purificato per facilitare una serie di studi diversi e migliorare gli schemi di purificazione. Questa nota applicativa presenta un approccio sistematico e conveniente sia per le separazioni analitiche che per uno schema di purificazione preparativa per un oligonucleotide 20 mer.

Durante lo sviluppo di farmaci, dalla scoperta iniziale fino allo sviluppo in fase avanzata, è necessario un adeguato materiale oligonucleotidico purificato per facilitare una serie di studi diversi e migliorare gli schemi di purificazione. Questa nota applicativa presenta un approccio sistematico e conveniente sia per le separazioni analitiche che per uno schema di purificazione preparativa per un oligonucleotide 20 mer.

Note Applicative

Note Applicative

I dati parlano da soli

I dati parlano da soli
Quattro iniezioni consecutive di 3 µL di Duplex C (0,40 mg/mL) utilizzando la colonna ACQUITY Premier BEH C18 per oligonucleotidi, 300 Å.
Determinazioni delle impurezze delle frazioni per un’analisi di purificazione da 25 mg.
Copertura completa (100%) della sequenza, presentata in un formato a mappa di punti, prodotta dalla frammentazione senza target MSE ad alta energia. 
Cromatogramma sperimentale osservato con un gradiente concavo (logaritmico) di 1,33 minuti su una colonna ACQUITY Premier ultra-corta per oligonucleotidi da 2,1 x 20 mm e utilizzato a F=1,5 mL/min e T= 70 °C.

Webinar e Risorse

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Materiali di consumo LC e LC-MS per Bioseparazioni - Cartellone

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Colonne ACQUITY Premier per l’Analisi degli Oligonucleotidi - Infografica

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Colonne ACQUITY UPLC e ACQUITY Premier BEH C18 per oligonucleotidi Manuale d’uso e manutenzione

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Standard per la tecnologia di separazione degli oligonucleotidi Manuale d’uso e manutenzione

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Colonne XBridge e XBridge Premier BEH C18 per Oligonucleotidi Manuale d’Uso e Manutenzione

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Purificazione degli Oligonucleotidi

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Quantificazione degli Oligonucleotidi

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Maggiori Informazioni sulle colonne in fase inversa per oligonucleotidi

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