Approcci Pratici all'Isolamento dei Peptidi
Introduzione
I peptidi svolgono un ruolo unico nello sviluppo di nuovi candidati farmaci e costituiscono una nicchia specializzata tra le terapie tradizionali a piccole molecole e i trattamenti con proteine più grandi. Con una maggiore efficacia, sicurezza e tollerabilità nell'uomo rispetto alle piccole molecole e con minore complessità e costi di produzione rispetto ai prodotti biofarmaceutici a base di proteine, i peptidi sono sempre più interessanti come candidati farmaci per molte condizioni mediche. I peptidi di sintesi possono essere utilizzati per studiare le relazioni struttura-attività tra substrati cellulari o essere essi stessi efficaci come farmaci. Indipendentemente dal fatto che i peptidi siano prodotti per passaggi utilizzando la sintesi peptidica in fase solida, la sintesi in fase in soluzione oppure isolati da sorgenti presenti in natura, quasi tutte le miscele di peptidi grezzi sono complesse e richiedono una purificazione. Anche se le reazioni di sintesi sono controllate con attenzione, si formano inevitabilmente impurezze che possono includere delezioni, troncamenti o sequenze chimicamente modificate, inclusi addotti di clivaggio o altri sottoprodotti formati durante il processamento.
Anche i progressi tecnologici nella metodologia analitica realizzati negli ultimi anni hanno influenzato la diffusione dei peptidi come strumenti diagnostici e terapeutici emergenti. I metodi analitici eseguiti su strumentazione allo stato dell'arte mostrano una migliore sensibilità e una risoluzione più elevata in un periodo di tempo più breve, che a loro volta portano a un fondamentale risparmio di tempo durante la produzione.
I peptidi di sintesi rappresentano una sfida unica nello sviluppo di un metodo di isolamento. Per gli studi futuri, la purezza e la resa dei peptidi target rappresentano fattori critici che influenzano i risultati sperimentali. Come accennato in precedenza, il numero di impurezze derivanti da sintesi, clivaggio e deprotezione di un peptide di sintesi può essere piuttosto elevato. L'isolamento del prodotto peptidico può essere migliorato applicando i principi di sviluppo del metodo che sono spesso associati all'HPLC analitica. I meccanismi di separazione utilizzati per creare un metodo di purificazione su scala preparativa più ampia sono gli stessi dei principi utilizzati su scala ridotta. La selezione della colonna, la scelta del modificatore di fase mobile, l'uso della temperatura e l'ottimizzazione del gradiente sono scelte che devono essere esaminate nello sviluppo di qualsiasi metodo di separazione. Lo sviluppo sistematico di metodi per l'isolamento dei peptidi può migliorare in modo significativo la purezza e la resa del prodotto. Mentre l'isolamento tradizionale dei peptidi viene generalmente eseguito utilizzando la cromatografia guidata da UV, l'utilizzo dell'isolamento guidato dalla massa, insieme allo sviluppo prudente di metodi semplifica il processo di purificazione grazie a una migliore discriminazione tra il peptide target e i contaminanti formatisi durante la sintesi e il clivaggio.
Requisiti del Processo di Purificazione dei Peptidi
L'obiettivo di qualsiasi strategia di isolamento è quello di purificare la maggior parte del campione nel minor tempo possibile con la purezza necessaria per eseguire esperimenti successivi. Per il tipico laboratorio che sintetizza molti peptidi diversi, è utile stabilire un protocollo di purificazione standard che possa essere utilizzato per la maggior parte dei campioni, consentendo al contempo un'ottimizzazione semplice quando necessario. Le modifiche apportate alla composizione della fase mobile, al modificatore o alla temperatura su colonne con prestazioni costanti tra analisi eliminano la necessità di disporre di più set di colonne per l'isolamento. Queste opzioni economiche per migliorare la resa e la purezza sono semplici e facili da implementare. Il processo ottimale di purificazione dei peptidi utilizza anche una strumentazione robusta, in grado di condurre isolamenti su una serie di scale analitiche e preparative. La semplice sostituzione della colonna con un diametro di colonna di dimensioni adeguate per l'isolamento su uno strumento versatile, con un ampio intervallo di velocità di flusso, permette di rendere efficiente la purificazione. Tutti questi fattori, considerati insieme, possono ridurre i costi complessivi associati alla purificazione dei peptidi.
Flusso di Lavoro per l‘Isolamento dei Peptidi
Un protocollo standard di isolamento dei peptidi (Figura 1) inizia con la definizione della quantità di peptide puro necessario per eseguire gli esperimenti. L'analisi dei peptidi grezzi fornisce una stima ragionevole della purezza del campione e, in combinazione con la quantità definita di peptide puro necessaria per studi successivi, è possibile calcolare il carico di massa stimato. Il carico di massa definisce le dimensioni della colonna di preparazione e, di conseguenza, la velocità di flusso richiesta sullo strumento LC selezionato.
Figura 1. Flusso di Lavoro per l'Isolamento dei Peptidi.
Il ridimensionamento geometrico a una colonna di grandi dimensioni della stessa chimica per l'isolamento segue l'analisi dei peptidi grezzi. Le equazioni di scala nella Figura 2 mostrano le relazioni tra diametro della colonna, lunghezza della colonna, caricamento di massa e velocità di flusso per spostare una separazione da una dimensione di colonna all'altra. L'espressione della pendenza del gradiente come % di variazione per volume della colonna, anziché come % di variazione per unità di tempo, contribuisce a preservare la risoluzione erogando lo stesso numero di volumi della colonna per ciascun passaggio del metodo del gradiente dalle condizioni iniziali a quelle finali. I metodi preparativi devono includere un'attesa iniziale alle condizioni di partenza per simulare il ritardo del sistema, espresso anche in numero di volumi della colonna, che si osserva sulla separazione su piccola scala. Una volta completata la cromatografia preparativa, le frazioni raccolte vengono valutate in modo analitico. Il peptide puro viene successivamente processato come definito dalle linee guida dell'utilizzatore.
Figura 2. Equazioni di scala.
I sistemi di cromatografia liquida più semplici configurati con pompa, iniettore, rivelatore UV e raccoglitore di frazioni sono perfettamente adatti per l'isolamento di peptidi (Figura 3). La rivelazione di massa, sebbene non richiesta per l'isolamento dei peptidi, identifica il target peptidico e riduce il numero di frazioni raccolte che richiedono analisi dopo l'isolamento. I composti che non ionizzano, o che ionizzano in modo insufficiente, vengono spesso rivelati con lunghezze d'onda UV basse. Al contrario, i peptidi con estinzione UV molto bassa vengono in genere rivelati facilmente con MS.
Figura 3. Schema di un sistema di cromatografia liquida di base.
Considerazioni sul Processo di Purificazione
Modalità di Separazione
Poiché le proprietà dei diversi peptidi sono così diverse, variano anche le modalità cromatografiche di separazione. Mentre la cromatografia in fase inversa è di gran lunga la modalità più diffusa per la purificazione dei peptidi, alcuni peptidi vengono isolati in modo più efficiente utilizzando una selettività alternativa come lo scambio ionico o la modalità in size exclusion. Queste tecniche alternative possono anche essere combinate con la fase inversa, creando un processo in due passaggi per i campioni difficili.
Fase Inversa
A causa della sua riproducibilità e dell'ampia applicabilità, la cromatografia in fase inversa è comunemente utilizzata per la separazione di molti tipi di composti, inclusi i peptidi. La silice legata C18, uno dei tipi più comuni di impaccamento in fase inversa delle colonne, è non polare. Fasi mobili in fase inversa, generalmente costituite da acqua con un solvente organico polare miscibile, come acetonitrile o metanolo, eluiscono i composti dalle colonne C18 in base alla loro polarità. Pertanto, più un peptide è di natura idrofobica, maggiore sarà la sua ritenzione su una colonna C18.
Sebbene C18 sia il sistema di impaccamento in fase inversa più diffuso, alla particella base possono essere legati anche altri ligandi (C4, C8, RP18, fenile e altri) per fornire una selettività alternativa per la separazione ottimizzata dei composti. Sebbene la silice sia stata uno dei primi substrati utilizzati per l'impaccamento in fase inversa, i materiali di impaccamento a base di silice impongono limiti alla velocità di separazione, alla risoluzione, al pH, alla temperatura e alla capacità di caricamento della colonna. La tecnologia brevettata* a particelle ibride, utilizzata nello sviluppo di nuovi substrati di colonna, crea particelle che possono essere utilizzate a velocità, temperature e pH più elevati, migliorando al contempo selettività, risoluzione, riproducibilità e durata della colonna.
*Brevetto U.S. n. 6.686.035 B2
Scambio ionico
La cromatografia a scambio ionico è stata a lungo impiegata per l'isolamento di proteine e altri prodotti biologici. Poiché gli amminoacidi in un peptide possono avere carica positiva o negativa, la cromatografia a scambio ionico può essere utilizzata per l'isolamento dei peptidi. Resine polimeriche naturali funzionalizzate come l'agarosio, polimeri di sintesi come il poli(metilmetacrilato) (MMA) o il polistirene divinilbenzene sono mezzi comunemente utilizzati per le separazioni di molecole di grandi dimensioni, poiché questi materiali riescono a sopportare i rigorosi requisiti di pulizia che devono verificarsi tra cicli e lotti di processo nei bioprocessamenti su larga scala. Le soluzioni di idrossido di sodio utilizzate in queste procedure operative sono dannose per i materiali a base di silice comunemente utilizzati per l'isolamento di piccole molecole e peptidi su piccola scala.
Esistono quattro tipi di scambiatori ionici: anione debole, catione debole, anione forte e catione forte. Lo scambio cationico viene utilizzato per trattenere e separare gli ioni con carica positiva su una superficie negativa, mentre lo scambio anionico viene utilizzato per trattenere e separare gli ioni con carica negativa su una superficie positiva. Le colonne a scambio anionico e cationico forte sono completamente ionizzate in un ampio intervallo di pH (2–12), mentre le colonne a scambio ionico debole vengono caricate in un intervallo di pH ristretto (da 9,5 a 5,5).
L'isolamento dei peptidi tramite scambio cationico è più comune dello scambio anionico, ma la modalità preferita dipende in realtà dalla sequenza peptidica. Per separazioni di peptidi eseguite a un pH inferiore a 3, le cariche negative sui gruppi carbossilici delle catene laterali degli amminoacidi vengono neutralizzate e i gruppi N-terminali vengono protonati, rendendo i peptidi carichi positivamente e attratti dai siti negativi sulla colonna a scambio cationico (Figura 4).
Figura 4. Attrazione del peptide all'impaccamento della colonna a scambio cationico.
Al contrario, per i peptidi più adatti alla separazione a un pH compreso tra 6 e 10, può essere utilizzato lo scambio anionico. Con lo scambio anionico a pH più elevato, i gruppi carbossilici sul peptide sono caricati negativamente e attratti dai siti positivi sulla colonna a scambio anionico (Figura 5).
Figura 5. Attrazione del peptide all'impaccamento della colonna a scambio anionico.
È possibile offrire alcuni suggerimenti generali per la selezione di una colonna e lo sviluppo di un metodo per l'isolamento dei peptidi utilizzando lo scambio ionico. Può essere utilizzato sia lo scambio anionico sia lo scambio cationico. Come punto di partenza generale, i peptidi acidi sono separati tramite scambio anionico e i peptidi basici tramite scambio cationico. Questa selezione può essere utilmente invertita per alcuni peptidi, in particolare per quelli di dimensioni maggiori, ma il pH deve essere regolato in modo che la carica netta sia opposta a quella del materiale di impaccamento.
Per entrambe le polarità, nel caso della cromatografia peptidica sono preferiti scambiatori forti. La carica su un peptide dipende dalla sequenza e dal microambiente intorno alle catene laterali cariche. Piccole regolazioni del pH della fase mobile possono essere utilizzate per regolare la selettività di separazione in base alla sequenza peptidica specifica. Queste piccole regolazioni della selettività non incidono sulla capacità di legame dello scambiatore ionico forte.
La selezione della fase mobile e delle condizioni operative è influenzata dalla pianificazione della separazione a scambio ionico come prima fase di una purificazione in due passaggi o come unico passaggio di isolamento che produce materiale sperimentale. Se il materiale raccolto dallo scambio ionico deve essere ulteriormente purificato con la fase inversa, i tamponi e le condizioni di eluizione possono seguire le prassi consuete per lo scambio ionico delle proteine; per esempio, utilizzando tamponi fosfato o Tris ed eluendo con un gradiente di cloruro di sodio. I sali verranno rimossi dal prodotto nel passaggio successivo.
Se si sceglie lo scambio ionico per produrre peptidi utilizzabili in un unico passaggio, è prudente scegliere tamponi volatili che possono essere rimossi mediante liofilizzazione. Il formiato di ammonio è una buona prima opzione, poiché presenta due regioni tampone corrispondenti ai pK dell'ammonio e del formiato. Può essere utilizzato da pH 3 a pH 4 per la cromatografia a scambio cationico di peptidi basici o da pH 9,25 a 10,25 per la cromatografia a scambio anionico di peptidi acidi. L'eluizione può essere effettuata con un gradiente di forza ionica con una concentrazione crescente di formiato di ammonio a pH costante. In alternativa, l'eluizione con un gradiente di pH riduce la lunga liofilizzazione da tamponi di forza ionica elevata. Anche in questo caso, i tamponi di formiato di ammonio rappresentano un utile punto di partenza. L'eluizione procede da pH alto a basso per i peptidi acidi sugli scambiatori anionici e da pH basso ad alto per i peptidi basici sugli scambiatori cationici.
Size-Exclusion
La separazione cromatografica delle molecole in base alle dimensioni, denominata oggi cromatografia in size-exclusion (SEC), risale agli anni '50. La separazione delle molecole in base alle dimensioni, piuttosto che alle loro proprietà chimiche come la carica o la polarità, è storicamente nota come cromatografia a filtrazione su gel o a permeazione di gel (GPC). Le particelle della fase stazionaria con una distribuzione delle dimensioni dei pori definita escludono le molecole del campione che sono più grandi delle cavità nel letto della colonna, provocandone l'eluizione molto rapida, mentre le molecole piccole entrano nei pori e, successivamente, percorrono un percorso più tortuoso e più lento verso l'eluizione. Pertanto, le molecole di grandi dimensioni eluiscono per prime, mentre le molecole più piccole eluiscono in ordine decrescente rispetto alle loro dimensioni in soluzione (Figura 6). La SEC è una tecnica a bassa risoluzione che utilizza metodi isocratici e non richiede equilibrazione tra le analisi. Il caricamento della colonna dipende dal volume del campione e dalla concentrazione, che influiscono entrambi sulla risoluzione.
Figura 6. Eluizione del campione con cromatografia in size-exclusion.
La SEC viene talvolta utilizzata come passaggio iniziale di pulizia per rimuovere sequenze troncate, peptidi con deprotezioni incomplete e altre impurezze. Al crescere in lunghezza di un peptide sintetico, il numero di questi contaminanti può essere significativo. Qualsiasi semplice passaggio di purificazione iniziale prima dell'isolamento mediante fase inversa riduce la complessità cromatografica. La SEC può essere utilizzata anche per lo scambio del tampone, ovvero per sostituire il tampone dal quale il peptide è attualmente disciolto con un altro tampone o soluzione più adatti per l'esperimento o il passaggio di purificazione successivi.
Riepilogo
I peptidi possono essere analizzati e isolati utilizzando molte tecniche cromatografiche diverse, tra cui la fase inversa, lo scambio ionico e la size-exclusion. La metodologia impiegata sulla scala di semi-preparazione (da pochi milligrammi a poche centinaia di milligrammi per l'isolamento) è in genere la fase inversa. La parte rimanente di questa discussione sull'isolamento dei peptidi sarà dedicata ai fattori e alle tecniche che possono essere utilizzati per ottimizzare l'analisi e la purificazione dei peptidi utilizzando la cromatografia in fase inversa.
In questo Primer
Approcci Pratici all'Isolamento dei Peptidi
Considerazioni sullo Sviluppo dei Metodi
