Guida alla SFC Preparativa per Principianti

Circuito Idraulico e Hardware

In seguito ai progressi dei moderni strumenti per SFC preparativa, sono stati superati molti degli ostacoli associati. La Figura 7 mostra il circuito idraulico generale per la strumentazione Prep SFC. La SFC utilizza lo stesso circuito idraulico di base dell’HPLC, inclusi il pompaggio binario e il controllo del metodo, l’introduzione del campione nel circuito idraulico tramite iniezioni, la separazione basata su colonna, la rivelazione dei picchi e la raccolta delle frazioni. Nella SFC sono necessarie ulteriori tecnologie, principalmente per gestire la comprimibilità e l’espansione della CO₂. Questi includono scambiatori di calore (HE), regolatori di contro-pressione (BPR), separatori gas-liquido (GLS) e l’uso quasi universale di tubi in acciaio inossidabile ad alta pressione.

Considerazioni per i Singoli Componenti

Pompaggio: nella SFC, come nella LC, i sistemi di pompaggio binario vengono utilizzati per erogare un solvente “A”, in questo caso sempre CO₂, e un solvente “B”, in genere un solvente organico polare come il metanolo. A seconda della scala del sistema, la CO₂ viene erogata in due modi: volume (flusso), che è tipico della scala analitica, o massa (flusso di massa), come spesso accade per la scala preparativa. Poiché la CO₂ è comprimibile, volumi identici non corrispondono necessariamente a massa identica a causa delle differenze di densità. Entrambi i metodi di erogazione sono validi purché le velocità di flusso siano riproducibili, indipendentemente dalle condizioni ambientali. Nella maggior parte dei casi, la CO₂ viene raffreddata prima della pompa o all’interno delle teste della pompa, quindi pompata come liquido per ridurre eventuali discrepanze nella densità della fase mobile. Inoltre, tutte le guarnizioni, le valvole di controllo, i tubi e i raccordi devono essere in grado di gestire un fluido comprimibile ad alta pressione senza perdite. Poiché la CO₂ si espande facilmente attraverso qualsiasi apertura, anche una piccola perdita può avere un forte impatto sulle prestazioni del sistema e sulla cromatografia. Uno scarso pompaggio della CO₂, dovuto a perdite nei tubi, nelle guarnizioni o nelle valvole di controllo, può comportare non solo variazioni del tempo di ritenzione e della selettività, ma anche uno scarso controllo della pressione (densità) e rumore di fondo.

Iniezioni: esistono due modalità di iniezione comunemente utilizzate, a flusso misto e a flusso di modificatori, che verranno discusse in dettaglio nella sezione “Strategie di iniezione nella SFC”. Gli schemi di iniezione SFC a flusso misto comportano una fase di depressurizzazione, utilizzata per scaricare l’eventuale CO₂ dal loop prima di caricare il campione. La depressurizzazione viene talvolta utilizzata anche in sistemi che eseguono iniezioni in flusso misto e in flusso di modificatore come precauzione di sicurezza. Di solito, questa operazione viene eseguita con una valvola di “sfiato” secondaria. Uno svantaggio di questa configurazione è il volume extra-colonna aggiunto al sistema durante l’iniezione, che può comportare l’allargamento dei picchi e una perdita di risoluzione. Mantenendo il volume al minimo utilizzando tubi con diametro interno ridotto, si riduce l’allargamento dei picchi.

Forno Colonna e Riscaldamento: nella SFC, pressione e temperatura sono parametri del metodo che incidono sulla separazione perché incidono sulla densità della fase mobile. Di conseguenza, sono necessari un adeguato riscaldamento e controllo della temperatura della fase mobile e della colonna. Se la temperatura non è controllata correttamente, i gradienti di temperatura che si verificano nella colonna possono avere effetti negativi sulla forma e sulla risoluzione dei picchi. In molti sistemi SFC ciò avviene riscaldando la colonna in un forno, preriscaldando la fase mobile o entrambe.

L’identificazione della corretta fase stazionaria della colonna (sia chirale che achirale) è fondamentale nella SFC. Lo screening delle colonne è pertanto necessario nelle applicazioni SFC. Molti sistemi SFC sono dotati di qualche tipo di valvola di commutazione inclusa nel forno per scegliere tra più colonne. Ciò è particolarmente importante nelle applicazioni in cui vengono purificati molti campioni e target diversi che probabilmente richiedono fasi stazionarie diverse per le colonne.

Rivelatori: tutte le tecniche di rivelazione tipiche utilizzate nella purificazione, quali UV/Vis, PDA, MS ed ELS, sono compatibili con la SFC ed è possibile utilizzare più rivelatori all’interno di un singolo sistema. In genere, i rivelatori UV/Vis e PDA sono collegati al circuito idraulico principale in quanto rivelatori non distruttivi e utilizzati per la rivelazione primaria. Le celle di flusso per questi rivelatori devono essere tarate in modo appropriato per le pressioni utilizzate nella SFC. I rivelatori distruttivi, come MS ed ELS, sono collegati tramite una tecnologia splitter che consente il controllo relativo del rapporto di splittaggio e condiziona il solvente per ottimizzare il segnale di rivelazione. È possibile registrare o utilizzare più segnali del rivelatore (o canali) per l’attivazione delle frazioni, ampliando il campo di applicazione della tecnologia sia per la SFC analitica che preparativa. L’uso di questi rivelatori in SFC è trattato in maggior dettaglio nella sezione “Rivelazione Ottica e MS nella SFC” di questo capitolo.

Regolatore di Contro-Pressione (BPR): il controllo della densità della fase mobile lungo la colonna è uno dei fattori più importanti nella progettazione degli strumenti SFC perché la solubilità e il fattore di ritenzione di tutti i composti sono strettamente correlati alla densità del fluido. Il controllo della densità si ottiene principalmente controllando la pressione all’interno del sistema. Il regolatore di contro-pressione è un dispositivo automatizzato progettato per controllare la pressione post-colonna (contro-pressione) del sistema a una pressione specificata nel metodo. Per acquisire una cromatografia adeguata e ripetibile, la pressione post-colonna deve rimanere costante (al valore impostato) anche in condizioni di gradiente e da un’analisi all’altra. 

Anche se la CO₂ è considerata supercritica al di sopra di 74 bar (~1073 psi) e 31 °C, in genere si sconsiglia l’esecuzione in condizioni vicine al punto critico, perché piccole variazioni di temperatura o pressione in questa regione comportano ampie variazioni di densità. Di conseguenza, i metodi sviluppati in questa regione sarebbero meno robusti in termini di ritenzione e risoluzione. Inoltre, quando si utilizzano co-eluenti, la separazione di fase è più probabile in condizioni di bassa pressione, con conseguente rumore di fondo. Pertanto, la maggior parte dei metodi SFC utilizza valori di regolazione della pressione più elevati, in genere superiori a 100 bar (1450 psi).

Attivazioni della Raccolta: in Prep SFC, le raccolte possono essere attivate su più canali e rivelatori utilizzando le modalità di raccolta di soglia, tempo e pendenza (definite nella tabella 3). La logica booleana viene utilizzata per una raccolta più intelligente, che richiede il rispetto di più di una condizione prima che venga eseguita la raccolta. Le condizioni per la raccolta possono includere combinazioni di modalità, come soglia e tempo, o combinazioni di segnali del rivelatore, come soglia UV e conferma di massa.

Tabella 3. Definizioni delle modalità di raccolta utilizzate nella SFC preparativa.

Anche il tempo di attesa di raccolta è importante ed è necessario determinare i tempi di attesa appropriati tra il rivelatore e il sistema di raccolta per il recupero ottimale dei composti target. Come nel caso dell’HPLC preparativa, questi tempi di attesa dipendono dalle velocità di flusso. Nella SFC, tuttavia, le variazioni nei tempi di raccolta si accompagnano anche alle variazioni nella composizione e nella pressione della fase mobile. Con l’uso di solventi di reintegro e altre tecnologie per mitigare l’espansione della CO₂, è possibile controllare meglio la temporizzazione in una serie di condizioni a una velocità di flusso impostata.

Strategie di Iniezione nella SFC

Attualmente, esistono due approcci all’iniezione di campione nelle applicazioni SFC: flusso misto e flusso di modificatore. Nell’iniezione in flusso misto, l’intera fase mobile (CO₂ e co-eluente) attraversa il loop e trasporta il campione nella colonna. Problemi comuni con l’iniezione in flusso misto sono la distorsione dei picchi e le variazioni del tempo di ritenzione causate dagli effetti del diluente. La pratica standard consiste nel dissolvere il campione nel modificatore polare (co-eluente). L’utilizzo di un solvente forte come il metanolo impedisce l’assorbimento di parte dell’analita nella fase stazionaria, con conseguente sfondamento del picco o distorsione. Per i picchi che vengono trattenuti meno, l’impatto è maggiore e la distorsione diventa più evidente. All’aumentare del volume di iniezione, i frammenti di solvente polare provocano disturbi localizzati nella fase mobile, distorcendo ulteriormente i picchi e riducendo al contempo la risoluzione. Questa strategia di iniezione richiede anche la depressurizzazione, che può influire sul caricamento e sulla ripetibilità dell’iniezione. Con l’iniezione in flusso misto, è stato dimostrato che diluenti con polarità simile alla CO₂ (come esano, eptano o altri solventi non polari) migliorano la forma dei picchi (Figura 8).

La seconda strategia di iniezione è l’iniezione in flusso di modificatore, in cui il campione viene iniettato nella porzione organica della fase mobile (co-eluente) prima della miscelazione con CO₂. È simile agli schemi di diluizione in colonna utilizzati nella purificazione LC. L’idea è di mitigare l’effetto del diluente introducendo il campione senza incidere sulla forza complessiva della fase mobile e mantenendo le percentuali di solvente programmate durante l’iniezione e l’analisi. In questo caso, il diluente deve corrispondere al co-eluente utilizzato per la separazione; tuttavia è possibile utilizzare altri diluenti. L’iniezione in flusso di modificatore migliora la forma e la risoluzione dei picchi, consentendo di ottenere volumi di iniezione e un caricamento maggiori (Figura 9).

Quando si utilizza l’iniezione in flusso di modificatore a basse percentuali di co-eluente, il tempo necessario per applicare il campione alla testa della colonna aumenta a causa della bassa velocità di flusso della pompa del co-eluente. A causa dell’elevata diffusione della fase mobile, è possibile che l’aumento del tempo di iniezione produca picchi più ampi rispetto alle iniezioni in flusso misto. Tuttavia, la forma dei picchi è ancora migliore rispetto alle iniezioni in flusso misto ad alto volume a basse percentuali di co-eluente. Anche se il flusso misto trasferisce il campione alla colonna più rapidamente, l’entità del disturbo in queste condizioni supera qualsiasi vantaggio. All’aumentare della percentuale di co-eluente, la scelta della tecnica di iniezione diventa meno critica, ma a basse percentuali di co-eluente il flusso di modificatori è significativamente migliore.

Rivelazione PDA e UV/Vis

Esistono considerazioni specifiche per la SFC quando si tratta di rivelazione ottica in SFC. Le variazioni nella densità della fase mobile e le differenze negli indici di rifrazione tra la CO₂ e il co-eluente creano rumore di fondo e deriva della linea di base nei rivelatori UV/Vis e PDA. Questi effetti sono particolarmente pronunciati in condizioni di gradiente. Nei rivelatori PDA la linea di base può essere regolata utilizzando canali a lunghezza d’onda singola e una compensazione della lunghezza d’onda che riduce il rumore di fondo e aumenta la sensibilità (Figura 10). Nei rivelatori UV/Vis l’impostazione di una singola lunghezza d’onda rende meno pronunciati il rumore di fondo e la deriva.

Dal punto di vista dell’hardware, le celle di flusso specifiche sono state progettate per gestire le alte pressioni delle applicazioni SFC e possono essere utilizzate nei rivelatori Waters 2998 PDA e 2489 UV/Vis. Le proprietà di progettazione delle celle di flusso, tra cui lunghezza del percorso, geometria e materiale della cella, sono state studiate per ottimizzare la rivelazione nelle applicazioni SFC.

Rivelazione MS

Uno dei grandi vantaggi della SFC è la capacità di accoppiare la selettività della fase diretta con la compatibilità MS. La CO₂ nella SFC non solo sostituisce i solventi non compatibili come esani ed eptani, ma, attraverso l’espansione dei gas, favorisce anche la nebulizzazione e la formazione di particelle all’interno della sorgente MS. La SFC è compatibile con l’acquisizione ESI, APCI e dual mode in un’ampia gamma di strumenti MS. Il rivelatore Waters ACQUITY QDa è particolarmente utile in Prep SFC perché è facile da usare. Tuttavia, a basse percentuali di co-eluente spesso non sono presenti ioni sufficienti per una rivelazione ottimale del segnale. Per questo motivo, in genere viene aggiunto un solvente di condizionamento (o solvente di reintegro) allo split per incrementare il segnale nel sistema MS. Un tipico solvente di condizionamento contiene una miscela di metanolo, acqua e un additivo (spesso idrossido di ammonio o acido formico). Vengono utilizzate molte altre miscele di solventi per il condizionamento, in un intervallo di velocità di flusso che dipendono dalle preferenze dell’utilizzatore, dal tipo di strumento MS e dalla scala dell’applicazione. Nella Figura 11 sono riportati esempi di rivelazione MS-ESI su un rivelatore Waters ACQUITY QDa con e senza solvente di condizionamento.

Rivelazione ELS

La SFC è compatibile anche con la rivelazione ELS. Proprio come con MS, viene utilizzata una frazione e viene aggiunto il solvente di reintegro per migliorare il segnale. Poiché la fase mobile SFC è così volatile, è necessario il solvente aggiuntivo per trasportare il campione e ottenere un segnale migliore nel rivelatore ELS. Dal punto di vista operativo, il controllo ELSD per la SFC è analogo a quello per la LC.

Raccolta in Prep SFC: Considerazioni sull’Espansione della CO₂

Le proprietà di una fase mobile in espansione sono importanti quando si considera il controllo della raccolta in Prep SFC. Al punto critico, 31 °C e 74 bar, l’espansione volumetrica della CO₂ pura alle condizioni atmosferiche (1 bar e 15 °C) è pari a circa 250 volte.

Nei sistemi SFC preparativi la CO₂ ad alta pressione esce dal regolatore di contro-pressione (BPR). Questa espansione volumetrica aumenta in modo esponenziale all’aumentare della pressione della CO₂ in uscita. Nei sistemi binari, come nella tipica fase mobile SFC, l’espansione diminuisce al diminuire della frazione di CO₂ e all’aumentare della frazione organica. Quando si verifica l’espansione, la capacità di dissoluzione della fase mobile si riduce sia per la mancanza di potere di solvatazione che per il raffreddamento Joule-Thomson. Il raffreddamento può anche causare la formazione di ghiaccio secco che può ostruire i tubi. La mancanza di controllo dell’espansione può causare la distorsione dei picchi nel circuito idraulico di raccolta, riducendo la purezza della frazione. Può anche comportare una perdita di recupero, poiché i composti target vengono inviati allo scarico o persi per vaporizzazione nel punto di raccolta.

Per raccogliere correttamente le frazioni, nella strumentazione SFC vengono utilizzate molte strategie per controllare l’espansione della CO₂ e i suoi effetti. In primo luogo, per mitigare i problemi di raffreddamento e associati, la fase mobile viene riscaldata in corrispondenza del punto di espansione iniziale, subito dopo il regolatore di contro-pressione. In secondo luogo, in molti casi viene aggiunto un solvente organico di reintegro, che non solo mantiene i composti in soluzione, ma contribuisce anche a controllare l’espansione abbassando la frazione volumetrica di CO₂. Un migliore controllo dell’espansione migliora la forma dei picchi post-BPR e migliora il recupero. Infine, la CO₂ viene scaricata o rimossa. In genere a tale scopo viene utilizzato un qualche tipo di dispositivo di separazione di fase, come i cicloni ad alta pressione o i separatori gas-liquido (GLS) (Figura 12).

I cicloni ad alta pressione spingono la parte più pesante (liquida) della fase mobile verso l’esterno e sul fondo del ciclone, consentendo al contempo la fuoriuscita di CO₂ al di fuori del centro e della parte superiore. Vantaggiosamente, i cicloni ad alta pressione non richiedono solvente di reintegro (anche a percentuali di co-eluente inferiori) poiché il potere di solvatazione della CO₂ viene mantenuto attraverso la valvola di raccolta, mentre nei cicloni avviene la separazione di fase. Tuttavia, ci sono anche diversi svantaggi. I sistemi di raccolta ad alta pressione richiedono materiali ad alta pressione, come l’acciaio inossidabile, e rappresentano un rischio maggiore per la sicurezza a causa degli spruzzi e dell’espansione associati al recupero delle frazioni. Questi sistemi limitano inoltre l’utilizzatore a un numero limitato di posizioni disponibili per la raccolta in un formato “closed-bed”. Il separatore gas-liquido (GLS) è un’opzione alternativa a bassa pressione che presenta numerosi vantaggi. I sistemi a bassa pressione consentono l’utilizzo di materiali con valori nominali di pressione inferiori e presentano un rischio per la sicurezza notevolmente ridotto. E sebbene per la raccolta sia in genere necessario ulteriore solvente, la rimozione più completa della CO₂ in condizioni di bassa pressione permette la raccolta open-bed, aumentando notevolmente il numero di frazioni che possono essere raccolte e ampliando l’applicabilità della tecnologia.

Selettività e Applicabilità Diverse

La Prep SFC fornisce un eccezionale aumento della selettività al processo di purificazione. Sebbene la tecnica SFC utilizzi generalmente la separazione in fase diretta, è incredibilmente flessibile perché consente l’uso di alcune colonne RPLC convenzionali e di solventi, estendendo l’intervallo di compatibilità dei composti. La capacità di coprire questo ampio intervallo di selettività è un chiaro vantaggio della SFC in quanto fornisce la separazione ortogonale all’interno di un’unica piattaforma, semplificando l’intero processo di purificazione.

Compatibilità SFC: Solubilità

La SFC opera, a livello di base, in una modalità di separazione cromatografica in fase diretta. In condizioni di funzionamento tipiche, la maggior parte della fase mobile è costituita da CO₂ non polare accoppiata a una piccola frazione di solvente organico polare; la separazione avviene su colonne a impaccamento di piccole particelle contenenti fasi stazionarie relativamente polari con funzionalità ad ampio spettro. A causa della bassa viscosità della fase mobile e delle colonne con particelle di piccole dimensioni, la SFC viene utilizzata principalmente nelle applicazioni per molecole di piccole dimensioni. Tuttavia, la gamma di applicazioni a peso molecolare più elevato eseguite tramite SFC è in continua espansione. Come altrimenti detto, la candidatura di un composto per la SFC dipende principalmente dalla solubilità. La SFC ha un intervallo estremamente ampio di solubilità. In effetti, come regola generale, qualsiasi campione possa essere dissolto in un solvente organico è un candidato per la SFC. Ciò è molto utile perché molte tecniche di preparazione dei campioni comportano la dissoluzione dei campioni in solventi organici, che possono essere iniettati direttamente negli strumenti Prep SFC.

Un’informazione utile relativa alla solubilità di un composto in solventi organici riguarda il coefficiente di partizione, generalmente indicato come LogP. In genere, il LogP è una misura della lipofilia o dell’idrofobicità di un composto. Nello specifico, è il rapporto tra le concentrazioni di un composto nelle due fasi di una miscela di due solventi immiscibili all’equilibrio; di solito acqua e 1-ottanolo. Poiché la CO₂ è un solvente non polare, i valori LogP sono un buon indicatore del comportamento di un composto in condizioni SFC. Valori bassi di LogP indicano una polarità più elevata, il cui risultato è una minore solubilità in CO₂ e una maggiore affinità per le fasi stazionarie polari delle colonne, mentre valori elevati di LogP indicano una bassa polarità che si traduce in una maggiore solubilità in CO₂ e in una minore affinità per la colonna. L’opposto di questo è vero nella RPLC, in cui la fase mobile è polare e la fase stazionaria è non polare.

Nelle applicazioni analitiche (UPC²), campioni meno concentrati e con caricamento inferiore possono contenere composti con valori LogP compresi tra -2 e 9. Nella SFC preparativa, tuttavia, è importante che i composti rimangano in soluzione quando vengono introdotti nella CO₂ in condizioni di caricamento elevato. È necessario testare la solubilità dei campioni che contengono composti molto polari o idrofili a concentrazioni e quantità preparative prima dell’iniezione nel sistema. Questa operazione viene in genere eseguita dissolvendo il campione in un solvente organico adeguato e introducendo quindi una piccola quantità di esano o eptano. Se il campione precipita fuori dalla soluzione, in genere si ritiene che non sia idoneo per la SFC preparativa.

Uno svantaggio di Prep SFC è la scarsa solubilità di composti altamente polari. Tuttavia, con l’aggiunta di una piccola quantità di acqua (come additivo, in genere inferiore al 5% v:v) alla porzione organica della fase mobile, è possibile utilizzare SFC per un intervallo ancora più ampio di polarità del campione. L’acqua aumenta la solubilità dei composti idrofili, rendendo possibile la separazione e la purificazione di tali composti. L’ambito di applicabilità degli SFC può, pertanto, essere esteso allo studio di peptidi, proteine, basi azotate e altri analiti idrofili. Anche se questa tecnica si è dimostrata utile nelle applicazioni polari, dovrebbe essere utilizzata con cautela nella SFC preparativa per evitare la precipitazione del campione o la formazione di ghiaccio all’uscita del sistema.

Applicabilità SFC: Co-Eluenti

La selezione del co-eluente è un parametro chiave nella SFC per lo sviluppo e l’ottimizzazione dei metodi cromatografici. Sia nella cromatografia liquida in fase diretta che in quella inversa esistono restrizioni sulla miscibilità dei solventi. Gli idrocarburi alifatici in fase diretta e l’acqua in fase inversa limitano l’intervallo di polarità dei solventi che possono essere utilizzati in tali separazioni. Nella SFC la CO₂ supercritica è miscibile sia con solventi organici in fase inversa che con solventi in fase diretta, dal metanolo agli eptani, consentendo di sviluppare una separazione in un’ampia gamma di opzioni di selettività dei solventi. Questo ampio intervallo di selettività aumenta notevolmente la gamma di applicazioni compatibili con SFC.

Applicabilità SFC: Colonne

Nella cromatografia in fase inversa la maggior parte delle separazioni viene eseguita su un numero limitato di fasi stazionarie, in colonne genere C₁₈ o colonne idrofobiche simili. Nella SFC è applicabile un’ampia varietà di fasi stazionarie chirali e achirali che abbracciano sia l’intervallo di fase inversa (non polare) che quello di fase diretta (polare). I composti basici, neutri e acidi sono eluiti correttamente nella maggior parte delle colonne, il che indica l’adeguatezza della Prep SFC per un’ampia gamma di funzionalità chimiche. L’utilizzo di una varietà di colonne può essere considerato uno svantaggio; tuttavia, è anche un’opportunità per ottimizzare la selettività per purificare un particolare composto. Le moderne fasi stazionarie Prep SFC offrono un potenziale aggiuntivo per un maggiore utilizzo della SFC per la purificazione chirale e achirale. In particolare, le colonne Waters Viridis e Torus sono progettate specificamente per l’applicazione SFC e offrono una migliore stabilità, un ampio intervallo di selettività e una migliore forma dei picchi; riducendo la necessità di additivi. La Tabella 4 mostra un elenco di colonne Waters che coprono l’intervallo di applicabilità di Prep SFC. La selezione delle colonne è un parametro chiave nello sviluppo e nell’ottimizzazione dei metodi.

Separazione Chirale

La SFC è di gran lunga la migliore soluzione cromatografica per la separazione di composti chirali, in quanto fornisce notevoli miglioramenti nell’efficienza e nella velocità di separazione rispetto ad altre tecniche cromatografiche, come l’HPLC in fase diretta. Le separazioni chirali si ottengono in genere utilizzando HPLC in fase diretta. Nella SFC queste separazioni vengono eseguite in tempi notevolmente inferiori, aumentando al contempo la risoluzione e riducendo il consumo di solvente.

Le colonne chirali sono quindi molto utilizzate nell’ambiente SFC, non solo per applicazioni chirali, ma anche per la separazione di diastereomeri, metaboliti, regioisomeri e altri composti strutturalmente correlati. Anche se le fasi a base di cellulosa e amilosio sono le più diffuse, sono compatibili anche altre fasi stazionarie chirali. Ciò presenta vantaggi nella purificazione di questi composti, quali frazioni di purezza più elevata, maggiore efficienza e risparmio sui costi grazie alla riduzione dell’utilizzo di solventi. La Figura 13 mostra la separazione chirale degli enantiomeri e dei diastereomeri della permetrina utilizzando sia HPLC in fase diretta che SFC.

Non è stato possibile risolvere tutti e quattro i picchi utilizzando l’HPLC; tuttavia sono stati risolti in meno tempo e su una colonna più corta con SFC.