Guida alla SFC Preparativa per Principianti

Considerazioni sul Metodo Analitico

Quando si intende eseguire lo scale-up di un metodo analitico ai fini della purificazione, è importante che la cromatografia sia la migliore possibile per l’applicazione. Una migliore risoluzione sulla scala analitica significa una cromatografia migliore sulla scala preparativa, con conseguente maggiore produttività e frazioni più pure. I metodi analitici devono tenere in considerazione anche le condizioni della tecnica preparativa, quali il riscaldamento della colonna, la modalità di iniezione, le perdite di pressione, la pressione del sistema e l’abbinamento delle colonne. Se la purificazione avviene tramite MS, anche tutto lo screening e lo sviluppo del metodo su scala analitica devono essere eseguiti utilizzando la rivelazione MS. Per i metodi a gradiente, la pendenza del gradiente e il tempo di equilibrazione devono tenere conto della differenza di volume tra i sistemi analitico e preparativo. È necessario tenere in considerazione anche l’effetto del diluente, poiché molte volte il caricamento analitico viene eseguito utilizzando iniezioni in flusso misto, mentre il metodo preparativo utilizza iniezioni in flusso di modificatore.

Caricamento

Tenendo presente la differenza nelle strategie di iniezione, gli studi di caricamento vengono in genere eseguiti prima sulla scala (analitica) più piccola. È importante conoscere la solubilità dei composti in un campione prima della sua introduzione nel sistema. La best practice nelle applicazioni preparative consiste nel caricare la maggior parte del campione con la minor quantità di solvente (campioni ad alta concentrazione). Tuttavia, il campione deve rimanere in soluzione anche dopo essere stato introdotto nella fase mobile di CO₂ combinata con fase organica. Una volta determinata una concentrazione accettabile, viene condotto uno studio di caricamento del campione in cui il volume di iniezione viene aumentato in modo incrementale fino a quando si perde la risoluzione o la cromatografia non è più utilizzabile per ottenere frazioni pure dei composti target.

Requisiti Generali per uno Scaling Efficace

Una volta sviluppato un metodo accettabile e completato uno studio del caricamento sulla scala analitica, è ideale che ritenzione e selettività siano uguali (o simili) nella fase di scale-up. Per scalare correttamente la cromatografia, diversi parametri devono rimanere costanti:

■ Le fasi mobili devono essere identiche; nella SFC ciò significa un co-eluente identico (solvente B) e che la necessità di CO₂ di qualità, pressione di ingresso, stato fisico (liquido o gas) e metodo di erogazione simili.

■ Le colonne devono essere della stessa struttura chimica, della stessa lunghezza e con le stesse dimensioni delle particelle per offrire le migliori possibilità di abbinamento cromatografico su scale diverse. Se sulla scala analitica si utilizzano colonne di dimensioni ridotte, il rapporto tra lunghezza e dimensioni delle particelle (L/dp) deve essere lo stesso tra le colonne.

■ I campioni devono avere la stessa concentrazione e lo stesso diluente disciolto.

Scaling Geometrico

Nella SFC preparativa, così come nella LC, i volumi di iniezione (caricamento) e le velocità di flusso sono riportati in scala geometrica.

Per mantenere la forma dei picchi e la capacità di caricamento, il volume di iniezione deve essere adeguato in base alle dimensioni della colonna. La capacità è determinata dalla seguente equazione:

dove Vol è il volume di iniezione (µL), D è il diametro interno della colonna (mm) e L è la lunghezza della colonna (mm).

Analogamente, per mantenere la qualità della separazione, la velocità di flusso viene scalata in base alle dimensioni della colonna. Con colonne di lunghezza e dimensioni delle particelle identiche, la scala geometrica della velocità di flusso è la seguente:

dove F è la velocità di flusso (mL/min) e D è il diametro interno della colonna (mm).

Volume di Sosta e Volume Extra-Colonna

Quando le colonne sono di lunghezza identica, sono necessarie modifiche al profilo del gradiente nel metodo preparativo in base al volume di sosta. Per eseguire queste regolazioni, è necessario misurare il volume di sosta sia per il sistema analitico che per quello preparativo. Per determinare il volume di sosta, in genere si aggiunge al co-eluente un composto o un solvente che fornisce un segnale UV e si analizza un gradiente senza colonna. In base al tempo di attesa trascorso tra l’avvio del gradiente alle pompe e il cambiamento del segnale al rivelatore, il volume di sosta può essere determinato moltiplicando il tempo di attesa per la velocità di flusso (Figura 25).

È anche importante prendere nota dell’impatto di qualsiasi volume extra-colonna, come tubi, valvole di iniezione, dimensioni del loop, celle di flusso del rivelatore e splitter, che possono provocare un allargamento di banda nella cromatografia finale. Per misurare il volume extra-colonna e l’allargamento di banda, la colonna viene rimossa e viene eseguita un’iniezione. Il tempo tra l’iniezione e la rivelazione, moltiplicato per la velocità di flusso, è pari al volume extra-colonna. La forma del picco senza colonna indica l’eventuale allargamento dovuto al volume extra-colonna. Poiché il sistema è dotato di idraulica per l’iniezione in flusso di modificatori, l’iniezione è stata eseguita con co-eluente al 100%, in modo che il volume possa essere determinato in modo più accurato e senza l’aggiunta di CO₂ dopo l’iniezione. I dettagli su questa procedura sono inclusi in Preparative OBD Column Calculator, un’applicazione online accessibile all’indirizzo www.waters.com. Il calcolatore di colonna è uno strumento di facile utilizzo che agevola tutti i calcoli di scaling da analitica a preparativa.

Considerazioni sulla Densità della Fase Mobile

Le semplici regole di scale-up per LC, pur essendo applicabili in SFC, non possono essere applicate direttamente in quanto presuppongono una densità costante della fase mobile. Lo scale-up nella SFC è più complesso, principalmente a causa della comprimibilità della fase mobile che causa variazioni di densità, pressione e temperatura attraverso la colonna e tra i sistemi. Le variazioni di questi fattori incidono sulla composizione e sulla forza della fase mobile. Gli effetti che ne derivano su ritenzione e selettività rendono più difficile il mantenimento del profilo di separazione tra i sistemi di scala analitica e preparativa.

Le variazioni di densità e temperatura non possono essere controllate direttamente, ma la cromatografia può essere abbinata correttamente su più scale regolando i seguenti parametri del metodo nella SFC:

■ Corrispondenza della pressione media (e quindi della densità media) tra i sistemi. La pressione media è pari alla somma delle pressioni anteriore e contro-pressione divisa per due. Le pressioni possono essere abbinate modificando l’impostazione del regolatore di pressione automatizzato sullo strumento analitico o preparativo per mantenere profili di pressione (densità) simili in tutta la colonna. Occorre notare che la corrispondenza della pressione media non garantisce sempre una corrispondenza del profilo di densità; tuttavia, i profili mostreranno una migliore concordanza.

■ Corrispondenza precisa della composizione della fase mobile di anidride carbonica e co-eluente. Si tratta fondamentalmente di una conversione di unità tra i sistemi da flusso volumetrico a flusso di massa (sul sistema analitico) o dal flusso di massa a flusso volumetrico (sulla preparazione) per ottenere fasi mobili equivalenti.

Nella SFC, la composizione del co-eluente è il parametro più importante che controlla la ritenzione dei picchi. Di conseguenza, lo scaling accurato della composizione del co-eluente è essenziale per lo scale-up del metodo. Abbinando il flusso di massa e la composizione di CO₂ e co-eluente con la pressione e la temperatura di uscita della colonna, è possibile uno scale-up affidabile da uno strumento basato sul flusso volumetrico a uno strumento basato sul flusso di massa.

Esempio di scale-up

In questo esempio il metodo analitico è stato sviluppato sul sistema UPC² con i seguenti parametri (tabella 6).

Per mantenere costanti la lunghezza della colonna e le dimensioni delle particelle, nel sistema preparativo è stata utilizzata una colonna Chiralpak IA 21 x 150 mm con particelle da 5 µm. Il volume di iniezione è stato scalato geometricamente, quindi l’iniezione di 10 µL sul diametro interno 4,6 mm è equivalente a un’iniezione di 208 µL su una colonna con diametro interno 21 mm. In questo caso, la pompa della CO₂ del sistema analitico era controllata dal flusso di volume, mentre la pompa del sistema preparativo era controllata dal flusso di massa. Di conseguenza, la velocità di flusso della CO₂ del metodo analitico doveva essere convertita in flusso di massa prima di calcolare lo scale-up geometrico. Ciò è stato fatto utilizzando la seguente equazione.

■ Flusso CO₂ = 2,67 mL/min

■ Densità CO₂ = 0,89 g/mL

■ Flusso CO₂ (massa) = flusso CO₂ x densità CO₂

■ Flusso CO₂ (massa) = 0,89 x 2,67 = 2,38 g/min

Poiché il co-eluente viene messo in scala normalmente (mL in mL) e la velocità di flusso del co-eluente era di 0,33 mL/min, la velocità di flusso analitica totale era di 2,70 g/min a circa 12% di metanolo. Queste velocità di flusso e percentuale sono state riportate in scala geometrica, ottenendo una velocità di flusso preparativa di 56 g/min sulla colonna 21 x 150 mm in condizioni di 12% di co-eluente.

Una volta determinati il flusso e la composizione, il profilo di densità doveva essere abbinato al sistema analitico utilizzando la stessa pressione media. La pressione anteriore sul sistema analitico era di 162 bar e la contro-pressione era di 120 bar (la caduta di pressione era di 42 bar), pertanto la pressione media è stata calcolata in 141 bar. Poiché la caduta di pressione sul sistema preparativo era di soli 24 bar, è stato necessario impostare la contro-pressione a 130 bar per corrispondere alla pressione media del sistema analitico. Infine, anche la temperatura è stata mantenuta a 35 °C. Utilizzando questi parametri, la Figura 26 illustra l’incremento corretto della separazione dal sistema ACQUITY UPC² al sistema Prep SFC. I profili sono gli stessi, tuttavia si osserva un leggero aumento della ritenzione nel sistema preparativo, probabilmente a causa della differenza nella strategia di iniezione. Il sistema analitico utilizzava l’iniezione in flusso misto, mentre il sistema preparativo utilizzava l’iniezione in flusso modificatore.

Iniezioni Sovrapposte

Per molte applicazioni vengono utilizzate iniezioni sovrapposte. Le iniezioni sovrapposte riducono l’intervallo tra i cicli di iniezione e minimizzano l’utilizzo di solventi. Anche le iniezioni sovrapposte migliorano significativamente la produttività poiché utilizzano tutto lo spazio cromatografico disponibile per la separazione e la purificazione continue. In genere, le iniezioni vengono eseguite mentre un campione già iniettato si trova nella colonna (o eluisce dalla colonna). Pertanto, per utilizzare iniezioni sovrapposte, sono necessari metodi isocratici. Per sovrapporre correttamente le iniezioni, è necessario determinare il tempo di ciclo (o tempo tra le iniezioni) corretto. Inoltre, il tempo di analisi totale è necessario per l’ultima iniezione nella sequenza per garantire che tutte le sequenze di picchi vengano eluite e raccolte. La Figura 27 mostra come questi valori vengono determinati e quindi applicati in una serie di iniezioni sovrapposte. Poiché il tempo di ciclo è circa la metà del tempo di analisi totale, vengono eseguite due iniezioni prima ancora che il primo picco target inizi a eluire. Dopo l’ultima iniezione, vengono eluite e raccolte due serie di picchi. In questo caso, l’utilizzo di iniezioni sovrapposte dimezza il tempo di processamento totale rispetto alle analisi convenzionali a iniezione singola.

Applicazioni di Esempio

A causa dell’estensione dell’intervallo di selettività della SFC descritto in precedenza, la tecnica è adatta a un’ampia varietà di applicazioni (Tabella 7).

Tabella 7. Applicazioni SFC preparatorie per area di mercato.

Indipendentemente dall’area di mercato o dall’obiettivo della purificazione, la SFC preparativa fornisce:

■ Selettività diversificata in un’unica piattaforma di facile utilizzo

■ Intervallo di scaling cromatografico

■ Maggiore produttività e risparmio di solventi

■ Ortogonalità rispetto alla LC in fase inversa

■ Separazione e purificazione di composti con similarità strutturale

In questa sezione sono presentati estratti di applicazioni di esempio per illustrare i diversi workflow e aree applicative. Tutte queste applicazioni sono consultabili integralmente sul sito web Waters www.waters.com.

Purificazione Chirale di Aromi e Fragranze Volatili tramite SFC

Una delle principali aree di applicazione della SFC è la separazione chirale. Così come gli enantiomeri dei farmaci chirali presentano una diversa attività farmacologica, la stereochimica dei composti aromatici e olfattivi determina il gusto, la qualità dell’odore e l’intensità. La purificazione di questi composti può essere piuttosto complessa a causa della loro volatilità. La SFC offre un’opzione rapida e a bassa temperatura per il recupero elevato di composti aromatici e aromatici chirali.

In questo caso, gli enantiomeri del linalolo e del terpinen-4-olo sono stati purificati rispettivamente dagli oli essenziali di lavanda e tea tree, utilizzando la SFC preparativa chirale con iniezioni sovrapposte. La Figura 28 mostra lo scale-up dei metodi analitici sulla colonna AD-H da 4,6 x 250 mm alla colonna AD-H semi-preparata da 10 x 250 mm. La separazione dell’olio di tea tree mostra che sono presenti entrambi gli enantiomeri del terpinen-4-olo, mentre l’olio di lavanda contiene solo uno degli enantiomeri del linalolo. I parametri del metodo Prep SFC sono visualizzati nella Tabella 8.

I metodi erano isocratici, quindi sono state utilizzate iniezioni sovrapposte, massimizzando l’efficienza della raccolta. Sulla base della cromatografia, il tempo di ciclo era di circa 3 minuti per l’olio di tea tree e 2 minuti per l’olio di lavanda. La purificazione chirale risultante mediante iniezioni sovrapposte è mostrata nella Figura 29, in cui sono stati processati 50 mg di olio di tea tree in meno di 40 minuti e 30 mg di olio di lavanda in meno di 30 minuti.

L’analisi delle frazioni è mostrata nella Figura 30, dove la purezza di tutte e tre le frazioni era superiore a 92%. Sono stati eseguiti studi di recupero utilizzando standard racemici del terpinen-4-olo e del linalolo con conseguente recupero del 70-80%, che è stato notevole dati i recuperi piuttosto bassi in genere riportati.

Purificazione Achirale di un Composto Farmaceutico Mediante Attivazione di Frazioni Basata su MS

Con la purificazione diretta UV i picchi non sono distinguibili tra loro dai rivelatori. Molti composti assorbono alla stessa lunghezza d’onda. La purificazione diretta sulla massa raccoglie le frazioni in base alla massa, che è un parametro molto più specifico perché distingue tra i target ed eventuali impurezze. Quando vengono sintetizzati principi farmaceutici attivi, a volte sono presenti impurezze intermedie nel prodotto finale.

Imatinib è un inibitore delle tirosin-chinasi utilizzato nel trattamento di tumori multipli. In questo caso, i prodotti finali e intermedi di reazione sono stati purificati per la sintesi di imatinib. Nella prima fase, la miscela è stata vagliata utilizzando tre colonne achirali e metanolo con e senza un additivo di idrossido di ammonio. I risultati dello screening sono mostrati nella Figura 31. La colonna BEH 2-EP e il metanolo con idrossido di ammonio sono stati scelti come migliori parametri del metodo per l’ottimizzazione e lo scale-up.

Per ottimizzare la separazione per lo scale-up, sono stati sviluppati gradienti focalizzati per l’intermedio e per il prodotto. La concentrazione del co-eluente all’eluizione è stata calcolata in base alla pendenza del gradiente di screening e al tempo di ritenzione per ciascun picco di interesse. L’intermedio eluisce al 14% di co-eluente mentre il prodotto eluisce al 29% di co-eluente. Sono stati sviluppati gradienti focalizzati di 2 minuti centrati su tali percentuali, a partire dal 5% in meno e terminare al 5% in più.

Per lo scale-up è stata utilizzata la stessa chimica della colonna e il rapporto tra lunghezza e dimensione delle particelle (L/dp) è stato mantenuto costante. La colonna analitica 3 x 50 mm con particelle da 1,7 µm (L/dp = 29,4) è stata messa in scala alla colonna preparativa 19 x 150 mm con particelle da 5 µm (L/dp = 30). La cromatografia con scale-up (focalizzata) e la raccolta diretta sulla massa sono mostrate nella Figura 32.