La tecnologia a fluido supercritico (SFx) è il concetto alla base della purificazione basata su SFC. Le tecniche Waters SFx includono l’estrazione (SFE), la cromatografia analitica (UPC²) e la cromatografia preparativa (Prep SFC); che utilizzano la CO₂ subcritica o supercritica come solvente primario. Sostituendo i solventi organici e acquosi liquidi con la CO₂, la tecnologia SFx fornisce un’alternativa ortogonale, rispettosa dell’ambiente e più conveniente rispetto alla purificazione a base liquida. La SFx è considerata una tecnologia “green” perché ha un impatto ambientale ridotto grazie all’assenza di spreco di solventi organici. Rispetto alla purificazione LC, questa tecnologia offre miglioramenti in termini di velocità e selettività, riducendo notevolmente il tempo e il costo necessari per passare da un materiale di partenza complesso a un prodotto finale. Con i recenti progressi nella tecnologia degli strumenti, il potere di separazione delle tecniche SFx sta diventando pienamente compreso per una vasta gamma di applicazioni di purificazione.

Molte sostanze richiedono condizioni estreme per raggiungere il loro stato supercritico e presentano proprietà indesiderate quando si trovano in tale stato. Nella Tabella 1 sono mostrate le condizioni del fluido supercritico e le proprietà associate di alcune sostanze supercritiche selezionate. A differenza di altre sostanze supercritiche, la CO₂ è generalmente considerata sicura perché non è infiammabile, esplosiva, tossica o corrosiva. Poiché lo stato supercritico della CO₂ è facilmente raggiungibile, a 31 °C e 74 bar, la densità può essere manipolata a temperature e pressioni entro un intervallo accettabile. Inoltre, a causa della temperatura critica relativamente bassa, è suscettibile di campioni termicamente labili. La CO₂ è anche relativamente poco costosa perché facilmente recuperabile da altri processi industriali; questo significa che ha un impatto neutro sui livelli di CO₂ nell’ambiente. Tutti questi vantaggi rendono la CO₂ la sostanza più comunemente utilizzata nelle tecnologie a fluido supercritico.

Un workflow di purificazione è costituito da più passaggi, che variano in complessità e necessità in base ai requisiti dell’applicazione. In linea di massima, un workflow di purificazione SFx contiene i seguenti componenti.

Materiale di Partenza o Campione: il campione può essere complesso, come in un prodotto botanico presente in natura, o relativamente semplice, come un candidato farmaceutico ben caratterizzato. Ciò determinerà l’eventuale necessità di preparazione del campione e l’entità della purificazione. È inoltre opportuno disporre di quante più informazioni possibili sul campione e sull’eventuale prodotto, quali stabilità termica, polarità, solubilità e reattività, che determinano il possibile trattamento del campione.

Preparazione del Campione: nella prima fase del processo di purificazione, il campione deve essere preparato in modo appropriato a seconda dello stato del materiale di partenza e dell’obiettivo o dell’ambito dell’applicazione. La preparazione del campione può prevedere diverse fasi, quali la macinazione, l’asciugatura, l’estrazione e il filtraggio o la semplice dissoluzione del campione in soluzione. L’estrazione con liquido supercritico (SFE) è il primo passaggio (preparazione del campione) in un workflow SFx. Viene in genere utilizzata in applicazioni che coinvolgono prodotti industriali grezzi, prodotti biobotanici o prodotti naturali.

Purificazione del Campione: la purificazione viene utilizzata per ridurre la complessità del campione o isolare un prodotto finale entro una certa specifica di purezza per l’analisi o la formulazione del prodotto. I campioni preparati tramite SFE sono in genere miscele complesse contenenti composti target e impurezze. In un workflow SFx, la cromatografia preparativa a fluido supercritico (Prep SFC) è la seconda fase (purificazione), in cui uno o più target vengono purificati da un estratto. La SFC preparativa può essere applicata anche a campioni preparati utilizzando molti metodi diversi, non solo tramite SFE.

Prodotto Finale: il prodotto finale è l’obiettivo finale del workflow. Possono essere dati e informazioni generati dall’analisi, un materiale perfezionato utilizzato in un processo o un prodotto finale che può essere utilizzato direttamente. Il prodotto finale determina la strumentazione e la metodologia necessarie per un workflow corretto. In un workflow SFx, l’analisi dei campioni prima e dopo l’estrazione (SFE) e la purificazione (Prep SFC) vengono eseguite utilizzando la UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC²).

Una qualsiasi di queste tecnologie SFx può essere utilizzata, se necessario, in workflow non SFx, come fasi di preparazione, purificazione o analisi.

La cromatografia liquida preparativa ad alte prestazioni (Prep HPLC) è da oltre 20 anni una delle tecniche di purificazione più utilizzate. In particolare, è un processo di separazione popolare nei settori della chimica fine, farmaceutico e biotecnologico, dove è ampiamente utilizzato per la purificazione dei prodotti. Nel corso di questo periodo, la Prep HPLC è diventata una tecnica molto efficiente e applicabile, in particolare per la purificazione achirale. La cromatografia liquida in fase inversa (RPLC) presenta il vantaggio di utilizzare una fase stazionaria quasi universale (C₁₈) e una miscela di acqua e acetonitrile in fase mobile con applicazione generale. La RPLC è compatibile con la spettrometria di massa (MS), e la RPLC accoppiata con MS (RPLC-MS) è stato l’approccio standard per la purificazione in molti ambienti di ricerca.

Nonostante la sua popolarità, la Prep HPLC presenta diversi inconvenienti. Il volume di fase mobile necessario per purificare una data massa di composto è elevato rispetto alla quantità di campione complessivo processato. Le frazioni tipiche Prep HPLC contengono grandi volumi di solvente (organico e acquoso) che crea un rallentamento per la produttività a causa del tempo e dell’energia necessari per asciugare e dare origine al prodotto finale.

I solventi utilizzati nella LC possono inquinare l’ambiente sia a livello locale (per evaporazione ed esposizione) sia in generale tramite la combustione dei rifiuti chimici. La cromatografia liquida in fase diretta (NPLC) è considerata ancora più dannosa per l’ambiente, in quanto la fase mobile è in genere costituita al 100% da solvente organico. A causa di questi fattori ambientali, l’acquisto e lo smaltimento dei solventi utilizzati nella LC stanno diventando sempre più costosi; creando un incentivo per processi con meno solventi o più ecologici. La tecnica SFC è una tecnica alternativa che può contribuire ad alleviare i rallentamenti e apportare perfezionamenti operativi in grado di abbreviare i tempi, lo spreco di solvente e i costi. Di recente, i progressi nella strumentazione SFC hanno portato a un rinnovato interesse per la tecnica come potente strumento per la purificazione chirale e achirale. L’SFC è un’alternativa più ecologica all’HPLC per l’analisi e la purificazione.

La cromatografia a fluido supercritico (SFC) è una tecnica cromatografica che utilizza la CO₂ subcritica (liquida) e supercritica come solvente primario nella fase mobile, in genere accompagnata da un solvente organico. Come tutta la cromatografia, l’SFC separa i componenti in base alla partizione degli analiti tra una fase stazionaria (colonna) e una fase mobile (solvente). Esistono molte somiglianze tra HPLC e SFC, per esempio: la SFC può essere eseguita utilizzando sia condizioni isocratiche che a gradiente ed è compatibile con tutte le tecniche di rivelazione standard come ultravioletto (UV), serie di fotodiodi (PDA), evaporative light scattering (ELS) e spettrometria di massa (MS). Il workflow generale Prep SFC è lo stesso dell’HPLC e comprende lo sviluppo del metodo, lo scale-up, la raccolta delle frazioni e l’analisi della purezza delle frazioni raccolte (Figura 3). È anche paragonabile alla RPLC in termini di recupero e purezza, per alcune applicazioni il recupero è migliore in SFC mentre per altre HPLC è la soluzione migliore.

La tecnica SFC in genere sfrutta i principi della cromatografia in fase diretta. Ciò che differenzia la SFC dalla HPLC è l’utilizzo della CO₂ come componente primario della fase mobile, che sostituisce i componenti liquidi non polari, come esani ed eptani. Poiché la CO₂ supercritica è un fluido comprimibile, la pressione e la temperatura diventano parametri importanti utilizzati per controllare la forza dei solventi, incidendo sulla ritenzione e sulla selettività. La CO₂ supercritica è favorevole alla purificazione cromatografica perché non è infiammabile, non è tossica e possiede un’elevata diffusività, una bassa viscosità e un eccellente potere di solvatazione. Negli ultimi anni la SFC è diventata un’attrattiva per i laboratori di purificazione, in quanto offre vantaggi significativi in termini di risparmio di solventi e produttività.

Uno dei principali vantaggi della Prep SFC è il minor utilizzo di solventi che si ottiene sostituendo la maggior parte della fase mobile con CO₂. Alla scala analitica questo vantaggio può essere ridotto, ma alla scala preparativa è piuttosto significativo. In molti laboratori di purificazione talvolta si dedica molto tempo alla rimozione dei solventi dalle frazioni raccolte, creando un rallentamento tra la purificazione di un composto e l’ottenimento del prodotto target o del risultato desiderato. Nella Prep SFC, la porzione di CO₂ della fase mobile viene rimossa al momento della depressurizzazione, lasciando solo una piccola quantità di co-eluente. Le frazioni risultanti hanno concentrazioni di prodotto più elevate, il che riduce il tempo necessario per la rimozione dei solventi e l’isolamento del prodotto. La frazione può anche essere analizzata direttamente senza necessità di arricchimento del campione o di fasi di concentrazione. Ciò è di particolare importanza per i composti che si decompongono rapidamente nelle normali condizioni di asciugamento lungo.

Altri vantaggi derivanti dal minor utilizzo di solventi organici nell’SFC sono il risparmio sui costi, la sicurezza in termini di infiammabilità e tossicità e il ridotto impatto sull’ambiente. Esiste un notevole vantaggio in termini di costi di approvvigionamento e smaltimento del solvente; tuttavia, si registrano anche risparmi dovuti al minor consumo di energia necessaria per la rimozione dei solventi. La SFC può anche evitare l’uso di solventi tossici come l’acetonitrile utilizzato nella tecnica RPLC e gli idrocarburi alifatici e i solventi clorurati utilizzati nella tecnica NPLC. La CO₂, come solvente, è relativamente poco costosa perché è un sottoprodotto proveniente da altri processi industriali ed è riciclabile.

Vantaggi della Prep SFC: Maggiore Produttività

Nella SFC la produttività aumenta grazie alla bassa viscosità e all’elevata diffusività della fase mobile, che migliorano velocità ed efficienza cromatografiche. La Figura 4 mostra un confronto tra le curve di Van Deemter di HPLC, UPLC, SFC e UPC². In cromatografia la velocità delle separazioni dipende in parte dalla velocità di diffusione del soluto nella fase mobile, all’interno e all’esterno della fase stazionaria. Le curve di Van Deemter per SFC sono più ampie e piatte rispetto a quelle per HPLC, il che indica che l’efficienza della cromatografia rimane elevata (valori bassi dell’altezza del piatto) all’aumentare della velocità di flusso (velocità lineare). In SFC, i coefficienti di diffusione più elevati si traducono direttamente in cromatografia a velocità più elevata.

A causa della minore viscosità della fase mobile, le pressioni della colonna e del sistema sono inferiori, consentendo velocità lineari fino a 3 o 4 volte quelle osservate in HPLC e l’uso di colonne di dimensioni più ridotte. La bassa viscosità si traduce anche in tempi di equilibrazione più brevi. Il risultato sono tempi di analisi brevi con un’elevata efficienza di separazione, che porta a una maggiore capacità di caricamento e a un tempo di ciclo di iniezione più rapido, parametri chiave per migliorare la produttività in qualsiasi processo di cromatografia preparativa. I composti puri possono quindi essere generati in un intervallo di tempo più breve, con conseguente aumento della produttività complessiva. Un esempio del risparmio di tempo e produttività tra HPLC e SFC è riportato nella Tabella 2.

La relazione ortogonale tra SFC e RPLC offre l’opportunità di migliorare la qualità del prodotto in molte applicazioni. La RPLC applica la colonna C₁₈ come una soluzione quasi universale, il che semplifica notevolmente lo sviluppo del metodo, ma la fase mobile acquosa limita l’intervallo di compatibilità con i solventi e la solubilità del composto. La SFC, d’altro canto, funziona bene con un’ampia gamma di diluenti organici, il che si traduce in una più ampia compatibilità con solventi e composti. Dispone inoltre di una vasta gamma di fasi stazionarie tra cui scegliere.

La SFC è ortogonale alla RPLC perché è generalmente considerata una cromatografia in fase normale e fornisce una varietà di opzioni di separazione in un formato cromatografico di facile utilizzo. In particolare, accoppiando la selettività di fase normale con un’elevata efficienza di separazione, la SFC presenta un vantaggio nella separazione di stereoisomeri, isomeri di posizione e composti strutturalmente simili. Per i composti non polari, la flessibilità della SFC consente l’utilizzo di colonne a fase inversa (come la C₁₈), mentre l’aggiunta di acqua come additivo estende il campo di applicazione nella regione più polare. Nelle applicazioni in cui i composti sono facilmente degradabili, la purificazione SFC è un’alternativa ideale perché le separazioni vengono eseguite rapidamente, senza acqua, e l’asciugatura della frazione viene completata a basse temperature e in meno tempo.

La Prep SFC è paragonabile alla RPLC in termini di recupero e purezza ed esiste una sovrapposizione nelle applicazioni che possono essere eseguite sia da SFC che da RPLC. La Figura 5 mostra i risultati di uno studio in cui una libreria di composti farmaceutici è stata sottoposta a screening per la purificazione tramite SFC e LC. È stato possibile purificare circa l’82% dei composti con entrambe le tecniche. Tuttavia, lo studio mostra anche come le due piattaforme siano complementari. Alcuni composti possono essere purificati solo tramite SFC (4%) mentre altri possono essere purificati solo tramite LC (8%). La flessibilità offerta dall’abbinamento delle due piattaforme offre maggiori opportunità di ottimizzazione della separazione e della purificazione. La SFC fornisce una selettività complementare alla RPLC, consentendo un approccio ortogonale nello sviluppo di metodi e nella separazione di campioni complessi. Eseguendo la purificazione in più fasi tra piattaforme o utilizzando una tecnica ortogonale per l’analisi delle frazioni, è possibile recuperare un prodotto più puro e ottenere più informazioni. La Figura 6 mostra un esempio di purificazione di un composto da una matrice complessa mediante separazioni ortogonali LC e SFC.