Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

Separare, identificare e quantificare accuratamente gli amminoacidi nell’ambito della ricerca, dello sviluppo e della commercializzazione di alimenti, mangimi e prodotti bioterapeutici è un compito impegnativo. Comune a queste applicazioni è la necessità di un’adeguata idrolisi del campione, un primo passo importante nel workflow per l’analisi di amminoacidi legati, come peptidi e proteine. L’idrolisi consente l’analisi degli amminoacidi rilasciati, che possono essere separati utilizzando metodi cromatografici a scambio ionico o in fase inversa.

Date le difficoltà del workflow di preparazione dei campioni, questo documento è stato compilato per fornire linee guida utili per l’idrolisi dei campioni. Il materiale contenuto in questo documento funge solo da punto di partenza per questo processo. A seconda del tipo di campione e della sua complessità, possono essere necessarie modifiche ai metodi di idrolisi descritti. Per ulteriori informazioni o suggerimenti per la risoluzione dei problemi relativi all’idrolisi o a una procedura specifica, contattare il produttore dello strumento di idrolisi o l’ente appropriato, vale a dire l’Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Waters non è in grado di fornire linee guida su tipi di campioni specifici.

Per analizzare i campioni idrolizzati (amminoacidi rilasciati) tramite HPLC o UPLC, Waters fornisce molte soluzioni che utilizzano la derivatizzazione pre-colonna in modo che gli amminoacidi possano essere analizzati tramite rivelazione ottica. Poiché si tratta di parte integrante del workflow, sono incluse brevi introduzioni al metodo Waters HPLC (AccQ•Tag) e alla soluzione UPLC di analisi degli amminoacidi (AccQ•Tag Ultra). Questo documento non contiene informazioni relative al metodo di analisi degli amminoacidi Waters Pico-Tag (con fenilisotiocianato come reagente di derivatizzazione pre-colonna). Anche se il metodo Pico-Tag è ancora disponibile, i metodi basati su AccQ•Tag offrono notevoli vantaggi in termini di prestazioni e sono consigliati per le nuove applicazioni.

Nota: questo documento è dedicato all’idrolisi e all’analisi degli amminoacidi da proteine/peptidi purificati, alimenti e mangimi. Non si tratta in modo specifico dell’analisi degli amminoacidi in campioni di urina, plasma, prodotti per la nutrizione parenterale totale o terreni di coltura cellulare. Per informazioni su queste applicazioni, visitare i siti web www.waters.com/AAA e www.waters.com/Kairos.

Linee Guida e Raccomandazioni Generali per l’Analisi

Data la natura ubiquitaria degli amminoacidi nell’ambiente, la contaminazione di fondo può facilmente contribuire all’analisi del campione con 20 pmol o più di alcuni amminoacidi, in particolare per la serina (Ser) e la glicina (Gly). La quantità può essere ridotta adottando precauzioni speciali. In alternativa, se viene idrolizzata una quantità di campione sufficiente a fornire un minimo di 200 pmol per amminoacido, il contributo della contaminazione di fondo può essere limitato a meno del 10%. Indipendentemente da ciò, per sfruttare la sensibilità delle moderne tecniche di derivatizzazione e dei sistemi cromatografici, che possono avere limiti di rivelazione pari o inferiori a 1 pmol, è fondamentale disporre di buone tecniche di laboratorio e di pulizia. Ovunque possono trovarsi fonti di contaminazione: vetreria sporca, animali da laboratorio, polvere nell’aria, impronte digitali e talco sono contaminanti comuni.

Anche se non esiste un unico sistema perfetto per migliorare la qualità complessiva delle analisi degli amminoacidi a basso livello, sono utili le seguenti considerazioni e prassi:

• Pirolizzare tutte le provette per idrolisi da 6 x 50 mm (codice: WAT007571) durante la notte a 500 °C per pulire il più possibile il vetro. Dopo aver rimosso le provette dal forno raffreddato, coprirle con un foglio di alluminio (pulito con acetone) e conservarle in un’area coperta.
• Tenere presente la potenziale introduzione di contaminanti da pipette, puntali monouso, siringhe e altri accessori utilizzati nella procedura.
• Prima dell’idrolisi, eseguire tutte le fasi di manipolazione con guanti puliti e privi di polvere e pinzette pulite. L’uso di mascherine chirurgiche può essere appropriato.
• Utilizzare sempre reagenti freschi. Ogni reagente può essere fonte di contaminazione. La prassi migliore consiste nel dividere i flaconi appena aperti in contenitori puliti più piccoli.
• Verificare settimanalmente la qualità dei reagenti con derivatizzazioni del bianco di controllo.
• Utilizzare sempre la procedura di idrolisi in fase vapore, quando possibile. L’HCl impuro può essere fonte di idrolisi inaffidabile. I nostri risultati più coerenti sono stati ottenuti con HCl a ebollizione costante. L’HCl concentrato di elevata purezza, di grado reagente, non è probabilmente così pulito e contiene livelli significativamente più elevati di cloro rispetto a quello a punto di ebollizione costante.
• Analizzare l’acqua e i costituenti del tampone per verificare l’eventuale contributo alla contaminazione di fondo come campioni di controllo. Per esempio, l’acqua bidistillata da laboratorio spesso contribuisce con livelli inaccettabili di amminoacidi. Per una qualità ottimale dell’acqua, si consiglia vivamente di utilizzare un sistema di purificazione (acqua da 18,2 mΩ-cm).
• Un bianco di controllo adeguato per l’idrolisi è una provetta per campioni trattata esattamente come viene trattato un campione. Ciò include il passaggio dell’idrolisi.