Primer sulla Spettrometria di Massa

Quando un composto è già noto, come nel caso di studi clinici in cui vengono raccolti dati statistici da molti campioni singoli e il farmaco somministrato e il suo metabolita di interesse sono già ben caratterizzati, non sono richiesti spettri di massa completi. Tuttavia, è richiesta un’ottima sensibilità in una miscela fisiologica complessa, quindi lo strumento è impostato per monitorare solo specifici valori m/z. (Fare riferimento al confronto tra la risposta SIR e MRM in precedenza in questo primer).

Poiché il flusso di ioni è continuo attraverso il quadrupolo triplo o tandem, non è necessario limitare la corrente ionica nell’analizzatore di massa. Il dispositivo di intercettazione ionica, d’altra parte, ha un volume finito definito e pertanto necessita di una funzione per evitare che troppi ioni entrino nel dispositivo di intercettazione. Il mancato controllo dell’intensità ionica genera picchi indesiderati o imprevisti in uno spettro, un fenomeno particolarmente problematico quando si tenta di eseguire una ricerca nella libreria degli spettri EI in GC-MS. Il design dei dispositivi di intercettazione ionica è stato sostanzialmente modificato per consentire la ionizzazione esterna (ioni creati all’esterno del filtro di massa con successiva iniezione di ioni nel dispositivo di intercettazione) anziché interna (ionizzazione all’interno del filtro di massa). La modifica al design risolveva il problema delle reazioni delle molecole ioniche nel dispositivo di intercettazione, ma introduceva anche una limitazione. Anche in modalità MRM questa regolazione automatica della corrente ionica totale può comportare intervalli di campionamento irregolari attraverso un picco cromatografico. Pertanto, in ultima analisi, il dispositivo di intercettazione ionica per l’analisi in tracce in matrici complesse è limitato, in particolare quando è richiesta la massima accuratezza e precisione, come nel caso dei dati che devono essere legalmente difendibili o i cui criteri rigorosi di accuratezza e precisione di quantificazione sono dettati dalle normative.

Quando si esegue la quantificazione MS, in genere viene utilizzato uno standard interno. Lo standard fornisce controlli sulla variabilità nei processi di estrazione, iniezione LC e ionizzazione. Senza uno standard interno, i valori RSD tra le repliche possono essere dieci volte superiori rispetto ai dati replicati con riferimento a uno standard che in genere produce valori RSD a cifre singole basse. Il miglior standard interno è una versione con marcatura isotopica della molecola di interesse. Anche se la sintesi di una tale molecola si dimostra costosa, il recupero per estrazione, il tempo di ritenzione cromatografico e la risposta di ionizzazione nello spettrometro di massa saranno simili.

La valutazione dell’adeguatezza del sistema, la randomizzazione dei campioni e la determinazione di curve e punti di concentrazione adeguati sono oggetto di lungo dibattito. Alcuni buoni riferimenti sono disponibili all’indirizzo https://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm

Calibrazione

I composti di calibrazione vengono utilizzati da uno spettrometrista di massa per regolare la scala di calibrazione di massa, nonché le intensità relative degli ioni, in modo che corrispondano a quelle delle entità note. Questa operazione viene eseguita su tutti gli spettrometri di massa perché lievi variazioni nei componenti elettronici, nella pulizia delle superfici e nelle condizioni ambientali di un laboratorio possono influire sulla capacità dello strumento di riprodurre una misura significativa. Per le analisi meno impegnative su strumenti a massa nominale, la necessità di calibrazione può essere poco frequente e un controllo della sua risposta più frequente. Tuttavia, un’elevata accuratezza di massa richiede una sorveglianza costante per eventuali modifiche minime.

Per GCMS, un composto di calibrazione popolare è FC-43, noto anche come perfluorotributilammina. Altre miscele di composti di calibrazione vengono utilizzate per regolare la scala di calibrazione di uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. Le miscele di ioduro di sodio e cesio (NaCsI) e di polietilenglicole sono molto diffuse per la LCMS. In un solvente compatibile con LCMS, NaCsI inviato in flusso o infuso in uno stato stazionario in uno strumento fornisce una serie di picchi monoisotopici fino a 4000 Da.

Sono disponibili kit contenenti una selezione di peptidi standard, proteine, matrici e solventi per la calibrazione, la regolazione e il test di sensibilità degli spettrometri di massa a desorbimento e ionizzazione laser assistiti da matrice (MALDI). Uno, di Sigma Aldrich, è un ausilio alla configurazione per l’analisi di miscele complesse di proteine e peptidi (da 700 a 66 000 Da).

Massa di riferimento

È necessaria una vigilanza costante per le misure più impegnative con ToF e strumenti simili ad alta precisione. Una piccola variazione di temperatura da sola può falsare i risultati di massa riportati di molte parti per milione. A seconda del tipo di ionizzazione utilizzata, è possibile ottenere una correzione costante della calibrazione utilizzando semplicemente un contaminante noto presente nella sorgente. In alternativa, è possibile campionare periodicamente un flusso ionico per ristabilire la calibrazione corretta nel corso di un’analisi. La semplice aggiunta di un calibrante di massa di riferimento all’eluente LC in flusso dopo la colonna e prima dell’ingresso dello spettrometro di massa, provoca spesso comportamenti incontrollati come la soppressione ionica, l’interferenza di massa e gli effetti del solvente.

Gli strumenti a tempo di volo (ToF) (descritti in precedenza in questo manuale) possono raggiungere valori bassi di accuratezza in parti per milione, mentre gli strumenti a risonanza ciclotronica ionica a trasformata di Fourier (FTICR) sono in grado di ottenere un’accuratezza ancora maggiore, purché il numero di ioni ammessi sia ben controllato. La ricalibrazione in tempo reale sulla massa di riferimento tramite correzioni di qualsiasi spostamento di massa rimuove l’errore di massa relativo a quello stabilito con la calibrazione della scala di massa. Il segnale debole è un’altra causa a volte trascurata, che può essere corretta calcolando la media della misurazione della massa sul picco LC, ponderata in base all’intensità del segnale.

Una sorgente a doppia elettronebulizzazione ottimizzata per l’acquisizione di dati di massa esatta è l’ideale per gli studi di proteomica o l’identificazione di metaboliti a basso livello. Il metodo che utilizza due sonde ESI indipendenti campiona il flusso di correzione spray (o riferimento), utilizzando un deflettore oscillante azionato da un motore passo-passo programmabile. Lo spray di riferimento viene campionato a intervalli predefiniti, in modo che il ciclo di acquisizione favorisca il flusso di liquido contenente l’analita. La posizione del deflettore del campione viene monitorata in tempo reale, consentendo l’indicizzazione dei due ingressi dei liquidi, mentre i dati di riferimento e del campione sono archiviati in file separati. Il design elimina le interferenze tra i canali dell’analita e di riferimento.