Guida all’SPE per principianti

SPE è Cromatografia

L’estrazione in fase solida ha le stesse basi fondamentali dell’HPLC. Qualsiasi conoscenza del comportamento cromatografico degli analiti di interesse e di altri componenti della matrice può essere di ausilio nella scelta del sorbente e degli eluenti adeguati. Se, per esempio, si sa che determinate condizioni cromatografiche garantiscono un’eccellente separazione dell’analita dalle interferenze, è possibile scegliere una combinazione simile di solvente e sorbente per la SPE. Analogamente, se nell’HPLC si tenta di rimuovere un’interferenza che coeluisce, si è certi a priori che condizioni simili per la SPE non avranno esito positivo.

Protocolli di Eluizione Generali

Esistono due strategie generali per isolare e pulire i componenti del campione di interesse:

• Adsorbire le interferenze della matrice mentre i componenti di interesse attraversano la cartuccia senza essere trattenuti.
• Adsorbire i componenti di interesse mentre le interferenze della matrice attraversano la cartuccia senza essere trattenute.

La prima strategia viene in genere scelta quando il componente del campione desiderato è presente in concentrazione elevata. Quando i componenti di interesse sono presenti a bassi livelli o quando è necessario isolare molteplici componenti di polarità molto diverse, in genere si utilizza la seconda strategia. Con la seconda strategia si ottengono anche un arricchimento in tracce dei composti presenti a livelli estremamente bassi e la concentrazione di campioni diluiti.

Passaggi di una Procedura di Estrazione in Fase Solida

Nella sezione seguente sono descritti i passaggi di una procedura completa di estrazione in fase solida. In molte applicazioni è possibile omettere uno o più dei passaggi elencati di seguito e successivamente descritti da esempi generali, semplificando in tal modo la procedura. Le procedure qui illustrate utilizzano campioni contenenti coloranti in modo che le separazioni possano essere visualizzate facilmente. La maggior parte dei campioni contiene componenti incolori che richiedono un qualche tipo di rivelatore o di test per essere individuati nelle frazioni raccolte. Utilizzare le seguenti informazioni come linea guida per lo sviluppo di procedure personalizzate o per la modifica di procedure pubblicate in letteratura.

1. Pretrattamento del campione
2. Condizionamento della cartuccia
3. Caricamento del campione
4. Eluizione delle frazioni

Cromatografia in Fase Diretta

Questa modalità è tipicamente utilizzata per separare composti organici neutri la cui natura chimica varia da idrofobica a moderatamente polare.

Per eseguire la cromatografia in fase diretta con cartucce SPE, utilizzare un gradiente a gradini di solventi non polari con un materiale di impaccamento polare.

1. Condizionare la cartuccia con da sei a dieci volumi di ritenzione di solvente non polare, in genere lo stesso solvente in cui è disciolto il campione.
2. Caricare la soluzione del campione sul letto della cartuccia.
3. Eluire i componenti indesiderati con un solvente non polare.
4. Eluire il primo componente di interesse con un solvente più polare.
5. Eluire i componenti di interesse rimanenti con solventi progressivamente più polari [più forti].
6. Una volta recuperati tutti i componenti, smaltire la cartuccia usata in modo sicuro e appropriato.

Questa procedura è illustrata nella figura seguente per un campione contenente una miscela di tre coloranti [giallo, rosso e blu] organici neutri e relativamente non polari che appaiono neri quando vengono inizialmente caricati sul letto della cartuccia.

Illustrazione di un Protocollo di Eluizione Generale per Cromatografia in Fase Diretta su Cartucce SPE
(Silice, Florisil, Allumina, Diol, CN, NH₂)

Cromatografia in fase inversa

A causa della molteplicità di campioni acquosi che abbracciano un’ampia gamma di applicazioni, dall’acqua ambientale a frutta e verdura, dalle bevande ai liquidi biologici, la cromatografia in fase inversa è diventata la modalità predominante della SPE.

Per eseguire la cromatografia in fase inversa con cartucce SPE, utilizzare un gradiente di solventi da fortemente a debolmente polari [intensità di eluizione del solvente da debole a forte] con un materiale di impaccamento non polare.

1. Solvatare la fase legata a silice o l’impaccamento polimerico con da sei a dieci volumi di ritenzione di metanolo o acetonitrile. Lavare la cartuccia con da sei a dieci volumi di ritenzione di acqua o tampone. Non lasciare asciugare completamente la cartuccia [a meno che non si utilizzi l’HLB].
2. Caricare il campione disciolto in un solvente fortemente polare [debole], di norma acqua.
3. Eluire i componenti indesiderati con un solvente fortemente polare.
4. Eluire i componenti di interesse debolmente trattenuti con un solvente meno polare.
5. Eluire i componenti più strettamente legati con solventi progressivamente più non polari [più forti].
6. Una volta recuperati tutti i componenti di interesse, smaltire la cartuccia usata in modo sicuro e appropriato.

Questa procedura è illustrata nella figura seguente per un campione di una bevanda acquosa all’uva contenente due coloranti alimentari polari [rosso e blu], oltre a zucchero e aroma artificiale [ma senza succo d’uva vero e proprio]. Appena versata in un bicchiere, questa bevanda appare di colore viola chiaro, poiché la concentrazione di colorante è diluita. Quando una porzione viene caricata su una cartuccia SPE preparata, i coloranti fortemente trattenuti si concentrano in prossimità dell’ingresso formando una banda di colore viola scuro.

Illustrazione di un Protocollo di Eluizione Generale per Cromatografia in Fase Inversa su Cartucce SPE
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

Cromatografia a Scambio Ionico

I composti ionici o ionizzabili spesso vengono isolati meglio utilizzando una cromatografia a scambio ionico. Questa modalità di separazione è ortogonale alle più utilizzate modalità in fase diretta e in fase inversa e fornisce una seconda dimensione potente e selettiva ai protocolli di preparazione dei campioni.

Illustrazione dei Due Principali Tipi di Fasi, Scambio Anionico e Cationico,
e di come Attraggono e Trattengono in Modo Selettivo Molecole di Carica Opposta

Per eseguire la cromatografia a scambio ionico con cartucce SPE, utilizzare un gradiente di pH o di forza ionica con un materiale di impaccamento a scambio ionico.

1. Condizionare la cartuccia con da sei a dieci volumi di ritenzione di acqua deionizzata o di un tampone debole.
2. Caricare il campione disciolto in una soluzione di acqua deionizzata o tampone.
3. Eluire i componenti indesiderati a legame debole con un tampone debole.
4. Eluire il primo componente di interesse con un tampone più forte (modificare il pH o la forza ionica).
5. Eluire gli altri componenti con tamponi progressivamente più forti.
6. Una volta recuperati tutti i componenti, smaltire la cartuccia usata in modo appropriato.

Questa procedura è illustrata nella figura seguente per un campione di una miscela acquosa di due coloranti ionici con valori di pK_a diversi. Quando vengono caricati sulla cartuccia, entrambi vengono trattenuti saldamente e la combinazione dei componenti blu e gialli viene visualizzata come una banda verde vicino all’ingresso.

Illustrazione del Protocollo di Eluizione Generale per la Cromatografia a Scambio Ionico su Cartucce SPE
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

Gli scambiatori cationici e anionici sono ulteriormente classificati come scambiatori deboli o forti, a seconda del tipo di gruppo ionico sulla loro superficie. Gli scambiatori cationici forti possiedono una frazione di superficie acida, per esempio un acido solfonico, che è sempre ionizzata [a carica negativa] nell’intero intervallo di pH. Gli scambiatori cationici deboli possiedono una frazione di superficie acida, per esempio un acido carbossilico, che ha carica negativa a pH alto ma è neutra a pH basso. Allo stesso modo, gli scambiatori anionici forti supportano in genere gruppi di ammonio quaternario che sono sempre a carica positiva, mentre gli scambiatori anionici deboli possiedono gruppi amminici primari, secondari o terziari che possono avere carica positiva a pH basso ma essere neutri a pH alto.

Utilizzare la seguente tabella come linea guida per scegliere il tipo di cartuccia SPE a scambio ionico appropriato per il proprio analita.

La cromatografia a scambio ionico in modalità mista combina l’uso delle modalità in fase inversa e a scambio ionico in un unico protocollo su una singola cartuccia SPE. Essa può essere utilizzata per isolare e separare composti neutri, acidi e basici da un’unica matrice complessa. Un substrato sorbente di SPE in modalità mista ideale rimane bagnabile con acqua e mostra al contempo una forte ritenzione di composti idrofobici in fase inversa. Sulla sua superficie sono presenti funzionalità di scambio ionico di uno dei quattro tipi generali sopra descritti. Per isolare composti neutri [inclusi gli analiti ionizzabili nel loro stato neutro] è possibile utilizzare lavaggi intermedi con miscele di solventi organici di adeguata forza di eluizione. L’eluizione selettiva di analiti ionicamente legati può essere ottenuta manipolando la carica dell’analita [quando legato a scambiatori ionici forti] o del sorbente [per analiti legati a scambiatori ionici deboli].