Guida Completa all’Idrolisi e all’Analisi degli Amminoacidi

Alimenti e mangimi sono costituiti da composti chimici che contengono amminoacidi essenziali per la crescita e la nutrizione. L’analisi del contenuto di amminoacidi è importante per garantire una corretta alimentazione. Tuttavia, questi prodotti sono fabbricati in processi in massa. Come per la produzione farmaceutica, i processi in massa possono variare nel loro output durante un’analisi di produzione. È necessario prestare attenzione a ciò che costituisce un campione rappresentativo. In genere è necessaria una strategia di sottocampionamento. L’analisi degli amminoacidi di questi prodotti richiede più approcci per analizzare correttamente i campioni per quanto riguarda la composizione proteica totale. Poiché gli alimenti e i mangimi sono prodotti in massa e contengono componenti non proteici, si raccomanda l’idrolisi liquida.

Nota: gli amminoacidi contenenti zolfo (cisteina e metionina) e l’amminoacido triptofano non sono stabili nell’idrolisi acida standard. Per analizzare efficacemente questi amminoacidi possono essere impiegate metodologie alternative.

In questa sezione presentiamo tre diverse procedure di idrolisi:

• Idrolisi acida: per determinare il contenuto proteico totale e la composizione
• Ossidazione con acido performico: per misurare gli amminoacidi contenenti zolfo (cisteina e metionina)
• Idrolisi alcalina: per valutare il recupero del triptofano

Quando si analizzano gli amminoacidi legati alle proteine, i legami peptidici devono essere scissi per liberare gli amminoacidi destinati all’analisi (Figura 1). Affinché i campioni di proteine del mangime vengano idrolizzati, è necessario tenere in considerazione il pH del campione e la presenza di solidi. Come accennato nelle sezioni precedenti, la velocità o l’entità dell’idrolisi variano a seconda degli amminoacidi presenti nelle proteine. Ciò è particolarmente vero per le proteine legate nei materiali alimentari. Come in ogni metodo di idrolisi, i parametri selezionati devono essere il risultato di un’attenta sperimentazione.

Nell’analisi dei mangimi, è necessario tenere presenti tre fattori di preparazione del campione:

1. Processamento del campione
2. Quantità di campione idrolizzata
3. Volume di acido utilizzato per l’idrolisi

3.2.1 Processamento del campione

Il mangime in granuli e campioni simili non sono normalmente uniformi. Per renderli il più uniformi possibile, i campioni devono essere ridotti in polvere fine. I campioni ad alto contenuto di grassi possono essere sgrassati con procedure standard prima della macinazione finale. Una polvere fine consente un’efficace idrolisi delle proteine nel mangime. Il metodo AOAC (4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int. 88, 2005, Amino Acid Analysis of Feeds) richiede che il campione di test venga macinato fino a quando non passa attraverso un setaccio da 0,25 mm o 60 mesh (dimensioni delle particelle 250 µm).

3.2.2 Quantità di campione

Il metodo AOAC per l’analisi degli amminoacidi nei mangimi consiglia di utilizzare il seguente calcolo per determinare la quantità di campione da utilizzare nell’analisi dei mangimi.

Calcolare la quantità approssimativa di porzione per test da utilizzare come segue:

Ws = 1000/Ns

in cui Ns = contenuto di azoto della porzione per test (%) e Ws = peso del materiale di test equivalente a 10 mg di contenuto di azoto (mg).

In generale, questo valore è compreso nell’intervallo 100-1000 mg di materiale per ciascun campione analizzato.

3.2.3 Volume dell’acido

Come notato in precedenza, è necessario un eccesso ponderale di acido per un’idrolisi efficace dei campioni di proteine. I mangimi non sono diversi. Tuttavia, a differenza dell’eccesso di 100 volte discusso nella sezione 2.1.2, il rapporto tra peso dell’acido aggiunto e peso del campione varia da 50 a 500 volte nel metodo AOAC 994.12. Questo intervallo e la presenza di particelle non proteiche sfuse nei mangimi indicano la necessità di un attento studio di determinazione dell’intervallo prima dell’uso in routine per l’analisi dei mangimi.

3.2.4 Standard interni

L’uso di uno standard interno (IS) compensa al meglio l’idrolisi variabile dei singoli amminoacidi del campione. Waters consiglia di utilizzare la norvalina (Nva) come IS per AccQ•Tag Ultra su UPLC e l’acido alfa-amminobutirrico (AABA) o la norleucina per AccQ•Tag su HPLC. Lo standard interno consigliato nel metodo AOAC 994.12 per l’analisi dei mangimi è la norleucina. È necessario prestare attenzione quando si sceglie un IS per assicurarsi di ottenere le risoluzioni desiderate tra i picchi degli amminoacidi nella cromatografia.

3.2.5 AOAC 994.12 Amino Acids in Feeds

La letteratura contiene una varietà di metodi che possono essere adattati all’analisi degli amminoacidi nei mangimi. Il metodo qui presentato è un adattamento del metodo 994.12 AOAC Amino Acids in Feeds.

• Bilancia analitica, leggibilità ±0.1 mg
• Bilancia, caricamento dall’alto
• Flacone da 50 mL; polietilene
• Sono adatti provette di digestione, matracci di ebollizione
• Sono adatti il blocco per digestione, il mantello riscaldante o il bagnomaria
• Unità filtranti, 0.22 µm (sono adatte Millex GS, Millipore)
• pH-metro, calibrato con tamponi a pH 2,0, 4,0 e 7,0
• Condensatore di riflusso
• Evaporatore rotativo
• Beaker di vetro, 250 e 1000 mL
• Matraccio Erlenmeyer, 150 mL
• Matraccio di evaporazione a fondo arrotondato, 1000 mL
• Cilindri graduati, 100, 500 e 1000 mL
• Matraccio volumetrico, 1000 mL
• Pipette volumetriche, 10 e 20 mL
• Filtro in vetro sinterizzato, porosità 10-15 µm
• Siringhe

• DL-norleucina, cristalli
• Acido cloridrico, concentrato
• Idrossido di sodio, soluzione al 30% (30 g/100 mL)
• Fenolo, cristalli
• Tiodiglicole, soluzione al 98%
• Tri-sodio citrato diidrato
• Tamponi di pH, pH 2,0, 4,0 e 7,0

Tampone sodio citrato, pH 2,20

1. Pesare 19,60 g di tri-sodio citrato diidrato in un beaker da 1000 mL.
2. Sciogliere in circa 800 mL di H₂O.
3. Sotto agitamento aggiungere 10 mL di soluzione di tiodiglicole al 98% e 15 mL di HCl.
4. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 1000 mL e diluire alla tacca con H₂O.
5. Filtrare la soluzione tampone attraverso un filtro di vetro sinterizzato.
6. Regolare il pH a 2,20 con HCl o 2 M NaOH.

Soluzione di 6 M HCl-fenolo

1. Pesare 1 g di cristalli di fenolo in un beaker tarato da 1000 mL.
2. Sciogliere i cristalli in 500 mL di H₂O. Mescolando, aggiungere lentamente 500 mL di HCl.

Soluzione di 1 M acido cloridrico

1. Versare circa 800 mL di H₂O in un matraccio graduato da 1000 mL.
2. Aggiungere 83,3 mL di HCl, utilizzando la pipetta.
3. Diluire fino alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Soluzione di 0,1 M acido cloridrico

1. Versare circa 800 mL di H₂O in un matraccio graduato da 1000 mL.
2. Aggiungere 100 mL di 1 M HCl utilizzando la pipetta.
3. Diluire fino alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Soluzione di idrossido di sodio (2 M NaOH)

1. Pesare 80,0 g di NaOH in un beaker tarato da 1000 mL.
2. Sciogliere lentamente i granuli nel beaker in circa 600 mL di H₂O.
3. Raffreddare la soluzione e trasferire quantitativamente in un matraccio graduato da 1000 mL.
4. Diluire alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Standard interno

1. Pesare accuratamente 195-200 mg di cristalli di DL-norleucina in un matraccio Erlenmeyer tarato da 150 mL.
2. Sciogliere con 100 mL di 1 M HCl.
3. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 1000 mL e diluire alla tacca con H₂O.

1. Pesare accuratamente 100-1000 mg di campione per il test finemente macinato con l’approssimazione di 0,1 mg (equivalenti a ca. 10 mg di azoto) in provette per digestione etichettate. Utilizzare il calcolo descritto nella sezione precedente per determinare la quantità effettiva di campione da utilizzare.
2. Aggiungere 50 mL di soluzione di 6 M HCl-fenolo alla porzione pesata e agitare brevemente. Aggiungere alla soluzione 2-3 frammenti di pietrine per ebollizione.
3. In una cappa aspirante idrolizzare a riflusso per 24 h a 110-120 °C utilizzando un blocco riscaldante o un bagnomaria equilibrato alla temperatura.
4. Rimuovere le provette per digestione dal fuoco e raffreddare a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 20 mL di standard interno di norleucina a ciascuna soluzione di test utilizzando una pipetta volumetrica. Miscelare le soluzioni facendo ruotare i matracci.
6. Filtrare gli idrolizzati attraverso un filtro di vetro sinterizzato in matracci di evaporazione a fondo arrotondato da 1000 mL.
7. Collegare i matracci agli evaporatori rotanti ed evaporare a 60 °C fino a secchezza.
8. Lavare aggiungendo circa 20 mL di H₂O e ripetere l’evaporazione. Ripetere due volte le fasi di lavaggio ed evaporazione.
9. Rimuovere i matracci dall’evaporatore.
10. Aggiungere 50 mL di tampone sodio citrato all’idrolizzato evaporato, miscelare bene e trasferire in un flacone di polietilene etichettato da 50 mL.
11. Il campione è pronto per essere preparato per la derivatizzazione.

La cisteina e la metionina sono amminoacidi critici nell’analisi delle materie prime per mangimi; entrambe limitano la crescita degli animali che consumano il mangime. Poiché le condizioni di idrolisi acida standard non funzionano per questi amminoacidi specifici, in genere viene eseguita un’ossidazione alternativa con acido performico. Questo approccio converte la cisteina e la cistina in acido cianurico e la metionina in metionina sulfossido (Figura 3). I campioni possono quindi essere idrolizzati con acido e derivatizzati in modo efficace.

In letteratura sono disponibili più versioni dell’ossidazione con acido performico. Anche se i processi complessivi sono simili, le specifiche differiscono. Questa guida presenta due procedure da utilizzare come possibile punto di partenza. Il primo metodo è tratto da AOAC 994.12. Il secondo è un metodo alternativo basato su MacDonald et al, 1985. Un’attenta valutazione e ottimizzazione sono necessarie prima di impegnarsi in un approccio specifico.

• Bilancia analitica, leggibilità ±0.1 mg
• Bilancia, caricamento dall’alto
• Flacone da 50 mL; polietilene
• Sono adatti provette di digestione, matracci di ebollizione
• Sono adatti il blocco per digestione, il mantello riscaldante o il bagnomaria
• Unità filtranti, 0.22 µm (sono adatte Millex GS, Millipore)
• pH-metro, calibrato con tamponi a pH 2,0, 4,0 e 7,0
• Condensatore di riflusso
• Evaporatore rotativo
• Beaker di vetro, 250 e 1000 mL
• Matraccio Erlenmeyer, 150 mL
• Matraccio di evaporazione a fondo arrotondato, 1000 mL
• Cilindri graduati, 100, 500 e 1000 mL
• Matraccio volumetrico, 1000 mL
• Pipette volumetriche, 10 e 20 mL
• Filtro in vetro sinterizzato, porosità 10-15 µm
• Bagno di ghiaccio
• Siringhe

• Acido formico, 88%
• Perossido di idrogeno, 30%
• Metabisolfito di sodio
• DL-norleucina, cristalli
• Acido cloridrico, concentrato
• Idrossido di sodio, soluzione al 30% (30 g/100 mL)
• Fenolo, cristalli
• Tiodiglicole, soluzione al 98%
• Tri-sodio citrato diidrato
• Tampone di pH, pH 2,0, 4,0 e 7,0

Tampone sodio citrato, pH 2,20

1. Pesare 19,60 g di tri-sodio citrato diidrato in beaker da 1000 mL.
2. Sciogliere in circa 800 mL di H₂O.
3. Sotto agitamento aggiungere 10 mL di soluzione di tiodiglicole al 98% e 15 mL di HCl.
4. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 1000 mL e diluire alla tacca con H₂O.
5. Filtrare la soluzione tampone su un filtro di vetro sinterizzato.
6. Regolare il pH a 2,20 con HCl o 2 M NaOH.

Soluzione di 6 M HCl-fenolo

1. Pesare 1 g di cristalli di fenolo in un beaker tarato da 1000 mL.
2. Sciogliere i cristalli in 500 mL di H₂O. Mescolando, aggiungere lentamente 500 mL di HCl.

Soluzione di 1 M acido cloridrico

1. Versare ca. 800 mL H₂O in matraccio graduato da 1000 mL.
2. Aggiungere 83,3 mL di HCl, utilizzando la pipetta.
3. Diluire fino alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Soluzione di 0,1 M acido cloridrico

1. Versare ca. 800 mL H₂O in matraccio graduato da 1000 mL.
2. Aggiungere 100 mL di 1 M HCl utilizzando la pipetta.
3. Diluire fino alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Soluzione di idrossido di sodio (2 M NaOH)

1. Pesare 80,0 g di NaOH in un beaker tarato da 1000 mL.
2. Sciogliere lentamente i granuli nel beaker in circa 600 mL di H₂O.
3. Raffreddare la soluzione e trasferire quantitativamente in un matraccio graduato da 1000 mL.
4. Diluire alla tacca con H₂O e miscelare accuratamente.

Standard interno

1. Pesare accuratamente 195-200 mg di cristalli di DL-norleucina in un matraccio Erlenmeyer tarato da 150 mL.
2. Sciogliere con 100 mL di 1 M HCl. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio tarato da 1000 mL e diluire alla tacca con H2_O.

Reagente per acido performico

1. Preparare in cappa. Pesare 25 mg di cristalli di fenolo in una provetta da 25 mL.
2. Aggiungere 0,5 mL di H₂O₂ al 30%, utilizzando una micropipetta.
3. Aggiungere 4,5 mL di soluzione di acido formico all’88%.
4. Coprire la provetta con il tappo e lasciare riposare la miscela per 30 minuti a temperatura ambiente.
5. Dopo 30 minuti, collocare le provette in un bagno di ghiaccio e raffreddare la miscela di acido performico per 15 minuti.
6. Preparare il reagente appena prima dell’uso.

1. Pesare accuratamente 100-1000 mg di campione di test finemente macinato con l’approssimazione di 0,1 mg (equivalente a circa 10 mg di contenuto di azoto) in provette per idrolisi etichettate. Utilizzare il calcolo descritto in precedenza per determinare l’effettiva quantità di campione da utilizzare.
2. Inserire un agitatore magnetico in ciascuna provetta e collocare le provette per digestione in un bagno di ghiaccio (0 °C).
3. Dopo che sia l’acido performico che la porzione per i test si sono raffreddati per almeno 15 minuti, aggiungere 5 mL di reagente dell’acido performico in ciascuna provetta per digestione; chiudere o tappare tutte le provette e agitare per 15 minuti.
4. Rimettere le provette per digestione nel bagno di ghiaccio e lasciare che i campioni si ossidino per 16 ore.
5. Rimuovere i tappi di vetro e aggiungere circa 0,84 g di metabisolfito di sodio per decomporre l’acido performico. Mescolare per 15 minuti per liberare SO₂.
6. Il campione è ora pronto per la fase di idrolisi acida.

1. Aggiungere 50 mL di soluzione di 6 N HCl-fenolo alla porzione pesata e agitare brevemente. Aggiungere alla soluzione 2-3 frammenti di pietrine per ebollizione.
2. In una cappa aspirante idrolizzare a riflusso per 24 ore a 110-120 °C utilizzando un blocco riscaldante o un bagnomaria equilibrato alla temperatura.
3. Rimuovere le provette per digestione dal fuoco e raffreddare a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 20 mL di standard interno di norlecucina a ciascuna soluzione di test utilizzando una pipetta volumetrica. Miscelare le soluzioni facendo ruotare i matracci.
5. Procedere con i passaggi (a-d) o (e-g) riportati di seguito.
   1. Filtrare gli idrolizzati attraverso un filtro di vetro sinterizzato in matracci di evaporazione a fondo arrotondato da 1000 mL.
   2. Collegare i matracci agli evaporatori rotanti ed evaporare sotto vuoto a 40 °C fino a circa 0,5 mL. Nota: non lasciare che la soluzione evapori fino a secchezza.
   3. Rimuovere i matracci dall’evaporatore.
   4. Aggiungere 50 mL di tampone sodio citrato all’idrolizzato evaporato, miscelare bene e trasferire in un flacone di polietilene etichettato da 50 mL.
   5. Filtrare gli idrolizzati nel matraccio da vuoto da 250 mL attraverso un filtro di vetro sinterizzato, quindi trasferire il filtrato in un beaker da 250 mL.
   6. Collocare il beaker in un bagno di ghiaccio.
   7. Neutralizzare parzialmente gli idrolizzati con circa 40 mL di 7,5 M NaOH, agitando. (Nota: la temperatura non può superare i 40 °C.) Regolare il pH a 2,20 utilizzando 2 M NaOH.

     6. Il campione è pronto per essere preparato per la derivatizzazione.

Nota: la letteratura contiene molti riferimenti diversi per questo saggio. Nessuno di questi concorda sulle quantità di acido performico e bromuro di idrogeno o sulla temperatura di evaporazione. La modifica delle quantità e/o della temperatura inciderà sul tempo di evaporazione nella fase 7.

• Provette da 25 x 150 mm con tappi
• Ghiaccio e bagno di ghiaccio
• Pipette volumetriche
• Evaporatore sotto vuoto
• Sorgente di azoto pulito
• Forno o blocco riscaldante
• Vetreria volumetrica
• Acido performico
• Perossido di idrogeno
• Acido formico
• Acqua ultrapura
• Soluzione di HBr, 48% in peso

1. Aggiungere un volume di perossido di idrogeno al 30% a nove volumi di acido formico all’88%.
2. Lasciare riposare il composto per un’ora, mescolando frequentemente.
3. Mettere la miscela in un bagno di ghiaccio per 30 minuti, quindi utilizzarla immediatamente.

1. Pesare campioni corrispondenti a circa 20 mg di proteine (con l’approssimazione al mg intero più vicino) in provette da 25 x 150 mm.
2. Collocare i recipienti in un bagno di ghiaccio per 30 minuti.
3. Aggiungere 10 mL di acido performico freddo ai campioni, agitarli delicatamente e chiudere con un tappo rivestito in Teflon.
4. Conservare i campioni (ancora in abbondante ghiaccio) a 0 °C per una notte (16 ore) in frigorifero.
5. Dopo 16 ore, con i campioni ancora a 0 °C, aggiungere 3 gocce di ottanolo e quindi 3 mL di HBr 48% raffreddato, facendo roteare lentamente i campioni. Eseguire questo passaggio in una cappa. Lasciare riposare i campioni a 0 °C per 30 minuti.
6. Evaporare a secchezza con evaporatore sotto vuoto a 37 °C. Questa operazione richiederà 1-2 ore.
7. Aggiungere 5 mL di 6 N HCl alle provette. Spurgare con azoto per 30 secondi, quindi tappare immediatamente.
8. Collocare i campioni in forno a 110 °C per 24 ore.
9. Toglierli dal forno e lasciar raffreddare.
10. Aggiungere 10 mL di standard interno attivo, 5,0 µmol/mL, e miscelare accuratamente. Nota: la concentrazione effettiva dello standard interno utilizzato dovrebbe essere calcolata per fornire la stessa quantità in iniezione nello strumento.
11. Trasferire quantitativamente i campioni in matracci tarati da 250 mL, sciacquando le provette dei campioni con acqua di grado HPLC e riempiendo i matracci alla tacca con i lavaggi.
12. Filtrare circa 1 mL di campioni del passaggio 12 attraverso un filtro del campione da 0,45 µm. Se non segue immediatamente la derivatizzazione, conservare i campioni tappati in un congelatore. Nota: la centrifugazione può sostituire questo passaggio di filtrazione. Centrifugare per produrre un surnatante limpido.

Nelle condizioni standard di idrolisi acida, il triptofano (Trp) è instabile e non può essere analizzato in modo efficace. L’idrolisi alcalina è un metodo alternativo per il rilascio e l’analisi di questo amminoacido presente nei mangimi. Questo metodo utilizza 4,2 M NaOH per idrolizzare la proteina. Un vantaggio di questo metodo è il fatto che al termine non è necessario alcun passaggio di derivatizzazione. È sufficiente l’analisi strumentale che utilizza la rivelazione UV a 280 nm.

La procedura qui presentata è un adattamento del metodo AOAC 988.15 Tryptophan in Foods and Food and Feed Ingredients.

• Matracci micro-Kjeldahl modificati (disponibili da Ace Glass, Inc.), matracci micro-Kjeldahl da 25 mL con diametro interno di 12 mm, collo lungo 15 cm. Il collo si contrae fino a circa 6 mm di diametro interno, 5 cm sopra il bulbo del matraccio.
• Pompa per vuoto
• Apparecchiature con filtri a membrana e filtri da 0,45 µm
• Ghiaccio secco
• Bagnomaria
• Etanolo per bagnomaria
• Pipette volumetriche e vetreria
• pH-metro

• Acqua purificata con il sistema Milli-Q (Millipore Corp.) o equivalente
• 4.2 M NaOH
• 1-ottanolo
• Soluzione tampone sodio citrato a pH 4,25
• HCl
• Soluzione standard di triptofano
  • Soluzione madre: 1 mg/mL. Sciogliere 250 mg di L-triptofano in 100 mL di H₂O con sei gocce di HCl. Diluire a 250 mL con H₂O.
  • Soluzione di lavoro I, 0,1 mg/mL. Diluire 10 mL di soluzione madre a 100 mL con H₂O.
  • Soluzione di lavoro II, 0,04 mg/mL. Diluire 4 mL di soluzione madre a 100 mL con H₂O.
  • Refrigerare le soluzioni standard quando non sono in uso. Preparare soluzioni fresche una volta al mese.

1. Macinare il campione del laboratorio in un macinatore centrifugo munito di setaccio da 1 mm; mescolare accuratamente.
2. Pesare una porzione per test contenente 100 mg di proteine in un matraccio micro-Kjeldahl modificato.
3. Per campioni di test con lipidi >5%:
   1. Aggiungere 10 mL di etere di petrolio alla porzione per test pesata contenuta nel matraccio.
   2. Agitare delicatamente per miscelare e sonicare per 20 minuti. Lasciar riposare. Se necessario procedere alla centrifugazione.
   3. Travasare la maggior quantità possibile di etere di petrolio, prestando attenzione a non rimuovere i solidi.
   4. Far evaporare l’etere di petrolio rimanente sotto un flusso delicato di N₂. Passare all’idrolisi.
4. Per i campioni di test con lipidi <5%: passare all’idrolisi.

1. Degassificare 4,2 M NaOH mediante ebollizione con N₂ per 10 minuti.
2. Aggiungere 10 mL di 4,2 M NaOH disareato in ciascun matraccio.
3. Aggiungere tre gocce di 1-ottanolo.
4. Congelare immediatamente la soluzione trattata in un bagno di ghiaccio secco/alcool etilico. Rimuovere quindi il matraccio dal bagno ed evacuare fino a 10 mm.
5. Spegnere il vuoto e sigillare i flaconi.
6. Collocare il matraccio sigillato in un beaker contenente H₂O a temperatura ambiente finché la soluzione di test si scioglie.
7. Collocare il matraccio in un forno a 110 °C per 20 ore.
8. Lasciare raffreddare i flaconi a temperatura ambiente.
9. Sciacquare il collo del matraccio con 1 mL di soluzione tampone sodio citrato a pH 4,25, raccogliendo il risciacquo in un beaker.
10. Trasferire quantitativamente l’idrolizzato nello stesso beaker da 50 mL, sciacquando il matraccio con due porzioni di soluzione tampone sodio citrato a pH 4,25.
11. Neutralizzare la soluzione con 3,5 mL di HCl e agitare energicamente. Regolare il pH a 4,25 ± 0,05.
12. Trasferire quantitativamente la soluzione in un matraccio graduato da 25 mL e diluire il volume con H₂O.
13. Versare la soluzione in una provetta da centrifuga da 40 mL e centrifugare per 20 minuti a 1150 G.
14. Filtrare il surnatante su filtro in vetro (Whatman GF/A).
15. Trasferire il filtrato in una provetta da centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 23 000 G.

Nota: a questo punto è possibile sottoporre un’aliquota del surnatante all’analisi UV (289 nm), senza derivatizzazione.